HPLC常见问题和对策Word文档下载推荐.docx
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13.不规则的基线噪音是如何产生的
14.保留时间漂移的故障排除
15.为何出现肩峰或分叉？
16.为何出现鬼峰？
17.为何出现峰拖尾？
18.为何出现峰展宽？
19.除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？
20.什么是强溶剂、弱溶剂？
21.怎样才会使峰位发生重排？
22.除了在线脱气常用的实验室脱气方式还有哪些？
23.评价一个色谱柱的最基本指标有那些？
24.什么是时间常数？
25.为什么在实验过程中有时会出现倒峰？
26.为何会出现“胖”峰和平头峰？
怎样避免？
27.什么是次级保留效应？
28.前延峰的发生及处理？
29.峰变宽的原因？
30.柱平衡慢的常见原因有哪些？
31.用内标法实验时对内标物的要求有哪些？
32.管子切割与安装注意事项？
33.什么是
的“无限直径效应”？
34.如何评价一台检测器？
35.如何简单判断比例阀是否内漏？
关于漂移问题：
①
温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
②
流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
③
柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混
合
筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的
柱子
可能柱超载，减少进样量。
样品量不足，解决办法为增加样品量
样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器
④
检测器衰减太多。
调整衰减即可。
⑤
检测器时间常数太大。
解决办法为降低时间参数
⑥
检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗。
⑦
检测池中有气泡。
解决办法为排气。
⑧
记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可。
⑨
流动相流量不合适。
调整流速即可。
⑩
检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校
正曲线。
泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
比例阀失效，更换比例阀即可；
泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
系统检漏，找出漏点，密封即可；
梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
能重现，为什么？
这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。
尽管过去几年来，填料的制造
技术有了极大的提高，但不同的厂商的
填料表面硅醇基的浓度不同。
正是这
些硅醇基可能与样品发生相互作用。
因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号
的
柱上的相对保留时间就可能不同。
在流动相中加入少量竞争物，如三乙基
胺（tea），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保
留时间具有较好的重现性。
如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。
柱压过高是
柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是
柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再
检查；
把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若
压力下降，再检查；
将柱子的进出口反过来接在仪器上，用
10
倍柱体积的流动相冲洗柱子，
（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。
这时，如果柱压仍不下降，
再检查；
只用于使用过的柱子。
更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正
是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，
在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题sge
提供的
rheo
dyne
7315
型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出
峰时间较短的条件下（不包括梯度），峰型应对称而尖锐。
但是，在对样品了解
程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到
的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。
下面根据本
人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。
色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。
我将这种情况分为四种原因。
1
色谱柱
如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会
减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题－柱头受损或柱头固定
相变脏或流失。
如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一
小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或
酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。
当
然不反冲，正冲有时也会正常的。
如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相
变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去
一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干
那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。
2
溶剂极性及进样量
许多
分析者对此可能不以为然，一般的
的书籍和文献都不会提到
这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的原因。
目前
分析多为反相
色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。
样品一般用
与流动相相溶的溶剂溶解。
最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不
一致的。
当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系
中以水为主，样品进样量大，如定量管为
20ul，此条件下完全可以肯定，单一的
纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提
前（相对进样量少而言），将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。
这是样品
的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。
上面
提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很
大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能
是色谱柱问题）。
将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过
载造成的。
3
样品的特性
有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无
法分开，而是以一个动态平衡存在。
在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种
物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其
ph，
双峰现象将消失，如红霉素等。
有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在
lc－ms
下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯
（吡虫清）。
4
参数
记录的参数一般都内定的，不必修改，但
gc
和
的参数是不完全一
致的，例如
c－r3a
数据记录仪上的一般记录时间间隔
为
2ms，hplc
为
5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：
不慎未及时补充流动相，泵将
溶剂瓶中的流动相吸干了，hplc
系统由此而停止工作了。
如此情况是否会损坏色
谱柱？
泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？
色谱柱还能使用吗？
事实上，
如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。
即使泵中充满了空
气，泵也不会将空气排入色谱柱。
因为泵只能输送液体，而不能输送空气。
相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子
太松而使色谱柱变干。
同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只
是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的
时间。
即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。
可以尝试用一种完全脱
气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。
较低
的表面张力有助于浸润填料表面；
已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料
中的气体。
色谱柱大约需要（以
1ml/min
的流速）冲一个小时或更多的时间被彻
底浸润，恢复到正常状态。
如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用
peek
材料制成的管路
和接头会非常方便。
管路容易连接；
接头不仅无需工具，手拧即可固定，
而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。
使用此类材料的管路需要注意的是：
对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不
好。
虽然未观察到上述溶剂溶解
材料的明显迹象，但
遇到上述溶剂会
变脆。
另一个西药考虑的因素是压力限。
不锈钢管可耐受
6000psi
的压力，但
peek
管只能耐受近
4000psi（但多数
应用系统压力不会超过
3000psi）。
使用
接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直
接接触。
但手拧固定的
接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会
使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。
10.
液相色谱梯度洗脱中柱温的影响
许多色谱工作者在操作液相色谱时，色谱柱是在室温环境下工作的。
如果实
验室的温度能保持不变的话，不会有什么大问题。
但大多数的工作环境温度是不
断变化的，因此若想将在某实验室开发的一种液相色谱方法应用到其他实验室的
话，温度的差别就会引起较复杂的问题。
温度的影响在所有的色谱
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