生化大实验实验报告2Word文件下载.docx

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多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、实验目的

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。

二、实验原理：

1.蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而将PPO蛋白从体系中析出。

2.大分子蛋白质不能通过透析膜。

三、材料与试剂

1.材料：

马铃薯（约每小组100-200g）

2.试剂：

0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×

10倍的浓缩液1000ml；

固体硫酸铵；

0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCl2）配置时配。

3.实验器械与仪器设备：

试管与试管架；

烧杯、玻璃搅棒；

移液管、滴管等；

试剂瓶；

透析袋；

过滤纱布；

植物组织匀浆器；

pH计和pH试纸；

GL－20C高速冷冻离心机；

DL一7A大容量低速冷冻离心机。

四、操作步骤

1.粗酶提取：

马铃薯组织按1：

1（W／V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5％甘油，1％聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

2.盐析分级沉淀：

在酶提取液中加入固体硫酸铵36.45g使其达到40%饱和度,边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min弃除沉淀，离心上清液再加入固体硫酸铵30.75g达到70%饱和度，边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀，沉淀用0.03M磷酸缓冲液Ⅱ（内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCl2,其液体pH6.0）溶解，装入透析袋中用0.02MKCl溶液透析至无硫酸根离子，获得粗酶液供上柱使用。

五、实验结果和分析

1.初提的酶液为米黄色，经过夜透析后，得到了澄清的略带黄色的液体，可以用来进一步的柱层析。

实验二：

胰蛋白酶原的提取与分离

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。

同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。

二、实验原理

胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶抑制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。

提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其他杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。

经此多次提取，最后在pH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。

胰酶在pH3.0时最稳定，可在低温下储存较长时间而不失活。

低于此pH，酶易变性；

高于pH5.0时，酶易自容而失活。

因此提取制备胰酶的全部操作过程宜在低pH和低温下进行。

胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。

胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我活化成为有活性的酶。

三、实验材料与试剂

新鲜猪胰脏

pH2.5乙酸酸化水、2.5MH2SO4溶液、2MNaOH溶液、0.1MHCl溶液、0.025MHCl溶液、0.01MHCl溶液、0.4MpH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。

1.胰蛋白酶原的提取与分离

（1）称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏后，加入2倍体积已预冷的乙酸酸化水提取。

在提取过程中，是提取液维持在pH2.5-3.0之间。

在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液。

用50ml乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1-2h，合并滤液，将滤液pH值调至2.5-3.0，放置3-5h后，收集滤液，量其总体积。

（2）盐析：

加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75%饱和度。

盐析溶液放冷室中过夜，次日4000rpm离心，或用布式漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，得到胰蛋白酶原粗制品。

2.胰蛋白酶原的激活

将胰蛋白酶原组分用10倍体积的冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，量其体积。

取出1ml溶液用于测定溶液中硫酸铵的含量。

因为硫酸铵可与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程。

因此按上述滤饼中含有的硫酸铵与钙结合生成CaSO4之后，尚保存0.1McaCl2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。

用5MNaOH溶液调节pH至8.0。

3.纯化

去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液pH至2.5-3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，得滤液。

加入已研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40%饱和度。

放置5℃冰箱中5-8h，抽滤除去沉淀，保留滤液。

再向该滤液中加入固体硫酸铵粉末使其溶液达75%饱和度，放5℃冰箱过夜，次日抽滤收集沉淀压干后称重。

五、实验结果与讨论

1.得到澄清的酶液。

2.用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。

3.提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。

实验三：

卵清蛋白分离提取

掌握鸡卵清蛋白的提取方法和操作步骤。

鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:

1。

鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。

有四种不同组份，等电点的范围为pH3.9－4.5,280nm的消光系数为：

A＝4.13（1％,1cm）。

鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定。

由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。

新鲜鸡蛋2只

10％TCA（用固体NaOH调pH至1.05～1.10，需要50ml）；

5NHCL；

5NNaOH；

冷丙酮；

胰蛋白酶液；

BAEE－0.05M；

pH8.0Tris－HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCl2，50ml。

）；

pH8.0，0.1MTris－HCL缓冲液。

1.取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25℃～30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸－丙酮（1:

2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4℃放置过夜。

2.次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。

3.边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000rpm离心5min，收集沉淀。

4.将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，4000rpm离心10min，去除不溶物，取少量上清液，用水稀释适当倍数，测A280计算所得蛋白总量。

五、实验结果与分析

1.上清液中得到含有分离提取的卵蛋白，所得卵清蛋白用于胰酶的柱层析。

2.在实验中要控制pH值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。

3.在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。

实验四：

凝胶色谱层析纯化PPO

通过凝胶色谱层析分离纯化PPO的操作，以期掌握凝胶色谱层析的基本原理、运用及操作技术，并了解凝胶色谱测定蛋白质分子量的基本原理和操作方法。

柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白质的手段。

在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。

选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下米，达到分离纯化的目的。

凝胶色谱技术使入十年代初发展起来的一种快速、简单的分离技术，设备简单、操作方便，对蛋白质等高分子物质有很高的分离效果。

其分离纯化蛋向质的原理使分子筛效应：

即

凝胶色谱柱的重要参数，由于凝胶色谱分离蛋白质是根据分子量大小进行的，蛋白质的洗脱体积与分子量对数大小负相关，因此利用标准分子量及其洗脱体积可作分子量－洗脱体积的标准曲线，根据曲线和未知蛋白的洗脱体积可以求得待分离蛋白的分子量人小。

1.试剂：

0.02MTris－HCL缓冲液Ph7.4（内含0.00lMEDTA）配制时配×

10倍浓缩1000m1；

NaCl；

聚已二醇；

DEAE－纤维素DE52；

葡聚糖凝胶SephadexG－200：

兰葡萄糖一40、70、100等；

2.实验器械与仪器设备：

试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；

试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机

1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡

（1）柱材处理

称取一定量的SephadexG－200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。

（2）装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。

层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。

（3）平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。

其方法是：

利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5－1ml/min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。

在本实验中用0.02MTris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001MEDTA）预先将DE—52柱进行平衡。

2.上样

将粗酶液上柱，用0.02MTris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001MEDTA）洗脱杂蛋白。

3.洗脱

用0.02MTris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001MEDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

实验五：

离子交换层析进一步纯化PPO

一、原理

离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有可解离的基团，在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。

当一定量的溶液通过交换柱是时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，全部被交换并吸附在树脂上。

交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至完全把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。

两种以上的成分被交换吸附在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。

蛋白质的洗脱过程分两个阶段——吸附和解吸附。

吸附在离子交换剂上的蛋白质通过改变PH使吸附的蛋白质火去电荷而达到解离。

通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。

不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数日不同，亲和力大小有差异。

二、实验试剂

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