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1黄酮类化合物的结构 

黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物[2]，其在植物体内大多与糖结合成苷类存在，小部分以游离态（苷元）的形式存在。

早期黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一类化合物，现在则泛指两个苯环（A环与B环）通过中央三碳相互联结而成的一系列化合物。

根据中央三碳的氧化程度、是否成环、B环的联结位置（2-或3-位）等特点[3]，可将该类化合物分成多种结构类型。

天然黄酮类化合物多为这些母体结构的衍生物，其常见的取代基有-OH、-OCH3、-OCH20-及异戊烯基、伽啡酰基等。

2玫瑰花黄酮类化合物的提取 

工艺流程：

原料预处理→称取→提取提取液→离心分离→取上清液测黄酮含量 

首先，建立玫瑰花总黄酮的测定方法，本实验采用分光光度法进行测定[4]。

其次，通过乙醇提取和微波辅助提取实验确定玫瑰花黄酮较优的提取工艺。

溶剂提取实验选择的研究因素为：

提取时间、提取温度、溶剂浓度、料液比；

微波辅助提取选择的因素为：

提取时间、微波功率、乙醇浓度、料液比、提取温度。

溶剂提取和微波辅助提取均先进行单因素实验，在单因素实验的基础上，再进行正交实验，以进一步优化提取的工艺条件。

由于黄酮类化合物在溶剂中的溶解性相差很大，没有一种能适合于所有黄酮类成分的提取溶剂，而必须根据目标成分的性质和杂质的类别来选择溶剂，常用的提取方法有以下几种。

采用溶剂提取及微波辅助提取工艺研究确定玫瑰花黄酮类化合物较优的提取工艺，并建立玫瑰花黄酮类化合物的测定方法。

2.1热水提取法 

热水提取法常用于各种黄酮苷的提取，提取时将原料投入沸水以破坏酶的活性，提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及次数等。

该法设备简单、工艺成本低、安全，适合工业化大生产，但提取的杂质多，收率低，所以并不常用。

水浸提银杏黄酮的较优工艺是浸提温度90℃，固液比l：

60，重复提取3次，每次1 

h。

2.2有机溶剂提取法 

乙醇或甲醇是最常用的黄酮类化合物提取的有机溶剂，该方法目前应用广泛，易实现工业化生产。

浓度高的醇适用于提取苷元，而浓度在60％左右的适于提取苷类，提取的次数一般为2-4次，可以用渗滤法、回流法和冷浸法，用不同浓度的甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂对山稔子中的黄酮类化合物进行浸提，然后分别测定浸提液中总黄酮的含量，实验表明，95％甲醇是浸提山稔子中黄酮类化合物的较理想溶剂。

2.3碱性稀醇或碱性水提取法 

黄酮类化合物大多具有多个羟基，故可以采取先用碱性液浸提，然后再经过酸化法来获得黄酮类化合物。

使用的主要碱性溶液有稀的氢氧化钠和石灰水。

这两种碱各有优势，氢氧化钠的浸出能力强，但浸出液杂质多，不利于纯化；

石灰水浸出效果不如氢氧化钠的好，但它能沉淀出某些黄酮类化合物而不被浸出[5]。

所以一般应根据不同的原料选用不同的碱液。

值得注意的是，所选的碱浓度不能过高，以免在强碱性条件下破坏黄酮类化合物的母核，导致其失去活性。

工艺流程为取葛根粗粉5009，加饱和Ca（OH）2水溶液（8倍量、6倍量、6倍量）分别提取2、l、O．5h，共3次，合并提取液，调pH值为5，减压浓缩后，浓缩液搅拌下以95％乙醇调醇浓度达65％，静置0．5h，过滤，回收乙醇得总黄酮。

2.4酶法提取 

植物提取物中的杂质大多数为淀粉、果胶、蛋白质等，可选用相应的酶利用酶法提取予以分解除去。

同时选用恰当的酶，还可以将油溶性的类黄酮转化为易溶于水的糖苷类而利于提取。

用果胶酶和纤维素酶对山楂叶中的黄酮进行酶解，然后再用水提取，大大提高了总黄酮的得率，提取率比乙醇提取法提高了16．9％。

用酶解法对山楂总黄酮提取，发现通过酶解，可将山楂中的果胶分解成小分子物质，使果肉中的黄酮类物质充分地释放出来，含量分析结果表明，酶法提取率比一般提取方法提高了2.3％[6]。

2.5微波提取法 

近年来发展起来的微波辅助提取技术，因其具有提取时间短、溶剂用量少及提取效率高等优点，越来越受到重视。

微波提取原理是微波射线自由透过对微波透明的溶剂，到达植物物料的内部维管束和腺细胞内，细胞内温度突然升高，连续的高温使其内部压力超过细胞壁膨胀的能力，致细胞破裂，细胞内的物质自由流出传递至周围的溶剂中被溶解。

Weihua 

Xiao等对微波辅助提取Radix 

Astragali总黄酮进行了研究，结果表明微波辅助提取Radix 

Astragali总黄酮提取率高、时间短。

赖雅平等用微波法提取了橄榄中总黄酮，结果表明微波提取法提取黄酮的提取率明显高于机械振荡法和超声波法，最佳工艺条件为：

乙醇浓度60％微波功率为500 

W，辐射时间25 

min，液固LL20：

1。

杨吲等比较了微波法和超声波法提取莲子芯黄酮的工艺，结论表明两种提取方法效果相差不大，但微波的提取时间较超声法要短。

水浴提取玫瑰花黄酮的较优提取条件为提取时间4．5h、料液比1：

45、乙醇浓度70％、提取温度65℃，在此条件下的提取率是82．54％。

微波辅助提取玫瑰花黄酮的较优提取条件为微波时间45min、料液比1：

55、乙醇浓度65％、提取温度65℃、微波功率700W，在此条件下的提取率是82．29％。

由以上两种提取方

法的结果对比可以得知，两种提取方法在各自的优化的条件下玫瑰花黄酮提取率相差不大，但是由于微波辅助提取法的提取时间仅为45min，相比于水浴提取法的4．5h的提取时间，提取时间大大缩短，所以本实验选择微波辅助提取法作为玫瑰花黄酮的最佳提取方法。

3黄酮类化合物的分离纯化 

树脂预处理→静态吸附与解析实验→动态吸附与解析实验→纯化的玫瑰花黄酮通过静态吸附与解析实验筛选出合适的大孔吸附树脂种类；

再利用筛选出的树脂进行动态吸附与解析实验，通过对上样液浓度、上样液流速、洗脱液浓度、洗脱液流速、洗脱液体积的考察，得到一个较优的玫瑰花黄酮类化合物的纯化工艺，并利用这个工艺纯化玫瑰花黄酮。

3.1聚酰胺柱层析法 

聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基团，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离。

从聚酰胺柱上洗脱被吸附的化合物是通过一种溶剂分子取代酚性化合物来完成的，即以一种新的氢键代替原有氢键的脱吸附而完成的。

聚酰胺对各种黄酮苷类有较好的分离效果，其层析容量较大，适合于制备性分离。

王怡红等用改性的聚酰胺柱对银杏黄酮类化合物进行了分离，实现了用普通分离方法得到高黄酮含量的目标物[7-10]。

3.2葡萄糖凝胶柱层析 

该法主要依靠分子筛作用分离黄酮苷类。

在洗脱时，一般按分子量的大d,J顿序洗出柱体。

对于分离黄酮类化合物，主要用两种型号的凝胶，包括Sephadex—G型及Sephadex—LH20型。

3.3硅胶柱层析法 

硅胶柱层析法在黄酮类化合物的分离纯化中应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢异黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化的黄酮及黄酮醇类。

少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其甙类等。

3.4大孔吸附树脂法 

大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的，近年来逐渐被应用于中草药化学

成分的提取分离和中药新药的开发研制，具有吸附快，吸附容量大，洗脱率高，树脂再生简单等优点，尤其适合于分离纯化黄酮类、皂苷类等成分及其大规模生产刘延吉等用AB一8型大孔树脂分离纯化南果梨黄酮类化合物，室温下最佳纯化条件为上样液为原液，上样流速为1．0mL／min，三倍柱床体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速2．0mL／min，纯化后得率为51．16％。

3.5梯度pH萃取法 

pH梯度萃取适合分离酸性强弱不同的游离黄酮类化合物的分离，根据黄酮类苷元酚羟基数目及位置不同其酸性强弱也不同的性质，可以将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）后，依次用5％碳酸氢钠（萃取出7、4’-二羟基黄酮）、5％的碳酸钠（萃取出7-羟基黄酮或4’-轻基黄酮）、0．2％氢氧化钠（萃取出一般酚羟基黄酮）、40％氢氧化钠（萃取出5-羟基黄酮）萃取而达到分离的目的[11]。

3.6铅盐沉淀法 

将粗提取液蒸干，残渣用水溶解，水溶液中加醋酸铅饱和水溶液以沉淀其中的杂质，滤去沉淀，溶液通硫化氢脱铅，减压浓缩放置，有时能析出苷；

否则可浓缩至干，浓缩物选用适当的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯萃取，必要时加活性炭处理，提取液浓缩后放置，有时也可得粗苷。

3.7高效液相色谱（HPLC）分离法 

HPLC法在分析测定黄酮类化合物方面起着重要作用。

随着色谱技术的不断发展，应用HPLC分离技术己分离了多种黄酮化合物。

近年来，对低极性苷元利用反相系统进行分离研究，对极性较大的苷元一般用C18或C8柱的反相系统分离。

在分离中较困难的是对含有较多组分的复杂黄酮类化合物的分离。

自20世纪70年代以来，超临界流体技术已经取得长足的进展。

超临界流体技

术正以其独特的优点受到关注，并在萃取、化学反应、材料制备等方面得到广泛的应用。

超临界萃取技术早己实现工业化，目前的趋势是向大规模、高附加值和套装工艺方向发展。

在国内外，超临界流体技术还广泛用于高分子聚合、有机反应、酶催化反应、材料制备等方面，目前各类报道颇多，但产业化的技术却为数不多，有望在不久的将来能形成规模生产，得到实际应用[12]。

超临界流体技术以绿色、环保而受到人们的关注，它为绿色化学提供了全新的反应体系，相信超临界流体技术必将得到迅速发展，应用也将有广阔的前景。

4生物分离的目的 

生物分离技术研究的目的是要缩短整个下游工程的流程和提高单项操作的效率，以前的那种零敲碎打的做法，既费时、费力，效果又不明显，跟不上发展的步伐。

现在对整个生物分离过程的研究要有一个质的转变，并认为可以从两个方面着手，其一，继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术；

其二，进行各种分离技术的高效集成化。

目前出现的新型单元分离技术，如亲和法、双水相分配技术、逆胶束法、液膜法、各类高效层析法等，就是方向一的研究成果，而作为方向二的高效集成化，目前研究比较热门的是将双水相分配技术与亲和法结合而形成效率更高，选择性更强的双水相亲和分配组合技术，将亲和色谱及膜分离结合的亲和膜分离技术；

可以将离心的处理量、超滤的浓缩效能及层析的纯化能力合而为一的扩张床吸附技术等。

目前看来，有关生物分离技术或过程的高效集成化研究还是很肤浅的，还不能与传统技术及过程的有效比较，尚未