ISO4833菌落总数的检测方法Word文档下载推荐.docx

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菌落总数测定——卫生学意义

判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。

及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。

通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

FDABAM菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

适当十倍稀释样品

选择2~3个连续适宜稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）

35℃48±

2h

菌落计数

FDABAM菌落计数方法

选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：

N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d

所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。

EAPC：

estimatedaerobicplatecount

所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。

所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100*1/d。

无法计数的平板报告LA（LaboratoryAccident）。

最终结果保留前两位有效数字。

按照4舍6入，5是奇进偶不进。

ISO4833-2003菌落总数测定流程

每皿内加入适量（12~15mL）

平板计数琼脂（PCA），

30±

1℃，72±

3h

ISO4833-2003菌落计数方法

选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下：

N=∑C/（n1+0.1*n2）*d

所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：

NE=m 

固体样品：

NE=m×

d-1

无菌生长：

液体样品：

lessthan1;

lessthan1×

菌落总数测定几点说明

由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。

鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）报告。

菌落总数测定几点要求

每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。

样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。

皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。

检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。

同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃放置，以便在计数检样时用作对照。

大肠菌群的定义

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。

根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠杆菌的定义

大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。

大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。

与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：

肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。

卫生学意义

大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。

食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。

大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。

近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

大肠杆菌的生物学特性

培养特性：

大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46℃

大肠菌群及大肠杆菌测定

——MPN法检验流程（FDABAM）

检样50g+450ml稀释液

选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，

每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），

每管接种1mL

35℃，24±

2h~48±

没有产气管 

有产气管 

报告阴性 

接种BGLB肉汤管 

接种EC肉汤

44.5±

0.5℃（水浴培养）

24±

查MPN表报告结果 

产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）

（大肠菌群） 

从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 

面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 

种LST复检产气

查MPN表报告结果（大肠杆菌） 

大肠菌群测定——MPN法检验几点说明

MPN检索表：

MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。

初发酵和证实试验：

1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。

初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。

有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。

因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。

产气量与倒管：

在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。

实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。

如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别

EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：

中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽

EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；

高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；

大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；

该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件

大肠杆菌测定——革兰氏染色

基本步骤：

将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；

滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；

滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。

结果：

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

大肠杆菌测定——生化鉴定

（表略）

金黄色葡萄球菌——概述

根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。

金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。

可引起局部化脓性感染，如疖、