第二章临床生物化学实验室基本技术与管理Word格式.docx
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能量转移----当光辐射通过某种物质时,组成该物质的分子与光子发生“碰撞”,光子的能量就转移至分子、原子上,使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态),这种跃迁称为激发。
选择吸收----组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光,所得到的光谱称为吸收光谱。
发e.g.,
射荧
光光
谱
吸
收激
光发
激发态(E1)
能量释放----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定,当其返回基态时,以热或发射光谱的形式将能量释放出来。
所发射出的相应光谱,称分子发射光谱。
E=E1-E2=hv
基态(E0)
4.分类
(1)吸收光谱分析法:
根据溶液能吸收由光源发出的某些
可见、紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry)*
原子吸收光谱法(atomicabsorptionspectrophotometry):
微量金属元素
红外分光光度法
波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。
(2)发射光谱分析法:
根据物质受到热能或电能等的激发
火焰发射光谱法(flameemissionphotometry):
碱金属/碱土金属元素
荧光光谱法(fluorometry):
少量无机物、酶活力、激素等
后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。
(3)比浊/散射光谱分析法:
测定光线通过溶液混悬颗粒后
的光吸收或光散射程度的一类定量方法。
比浊法(turbidimetry):
在光源的光路方向上测定透射光强度(透射光&
散射光)与入射光强度的比值和胶体溶液中质点浓度间的关系。
散射测浊法(nephelometry):
在光路的垂直方向上测量散射光强度和胶体溶液中质点间的关系。
5.特点:
灵敏度高;
测定简便、快速;
试样不被
破坏等。
II.可见、紫外分光光度法
根据物质分子对于200nm~700nm光区
电磁辐射的吸收特性进行分析的方法。
可见光:
400~700nm,有色物质溶液
紫外光:
200~400nm,无色物质
2.特点:
灵敏度高(10-4~10-7g/ml);
选择性强;
精确度和准确度高;
仪器设备简单,操作易掌握
3.吸收光谱
(1)光谱的产生:
化合物分子的价电子跃迁
(2)吸收光谱曲线:
电子跃迁的吸收波长和吸收强度可用仪器测定,在可见、紫外光区内绘制或扫描得到一条以波长()为横坐标,吸光度(A)为纵坐标的吸收曲线。
4.光吸收的基本定律(Lamber-Beer’sLaw)
(1)定律:
单色光通过吸光溶液后,吸光度与浓度或厚度之间呈正比关系。
Lamber定律:
说明吸收与厚度间的关系
Beer定律:
说明吸收与浓度间的关系
(2)表达式:
-lgIt/Io=abc*It/Io为透光率(transmittance,T)(%)
A=-lgT=abc*A为吸光度(aborbance)
*a为吸光系数(absorptivity),即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。
b为液层厚度
c为溶液浓度(concentration)
5.比色法(colorimetry)
(1)定义:
用可见光作光源,比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法
(2)所用仪器:
分光光度计(spectrophotometer)
(i)基本原理:
溶液中的物质在光的照射激发下,产生了对光吸收的效应,物质对光的吸收是具有选择性的。
各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,故当某单色光通过溶液时,其能量就会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系。
(ii)结构组成(以722分光光度计为例)
光源:
可见光区的光源为钨灯,波长范围是320~1000nm。
(紫外光区的光源为氢灯或氘灯,波长是200~320nm)
单色器:
一种将光源产生的混合光分解为单一波长的光学系统。
一般是根据通过棱镜的折射或光栅的衍射而获得的。
试样室:
由比色皿座架及光门组成。
可见光区用光学玻璃比色皿(紫外光区用石英比色
皿)
光电管暗盒:
由光电管(可将光能转变为可以放大检测和记
录的电能)和微电流放大器组成。
显示器:
由放大器和读数元件组成。
(3)比色法的定量方法:
(i)标准曲线法:
将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后,分别测吸光度(A),以A为纵坐标,浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。
在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度,即可从标准曲线找出相对应的浓度。
(ii)对比法:
将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。
由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致,故标准与待测样品a&
b值相等,可用下式比较计算待测样品浓度Cx=CsAs/Ax
III.实验内容
1.可见光分光光度计波长校正
(1)原理:
镨钕玻璃是一种含有金属镨与钕的玻璃制品,在可见光波长范围内,它具有特征性的吸收光谱,吸收峰的波长固定,可作校对仪器波长正确性的依据。
(2)操作:
用镨钕玻璃与空白光路作对照,作出波长从512~541nm的镨钕玻璃吸收曲线,以横坐标为波长,纵坐标为吸光度,每隔2nm作一个点,查找529nm处是否有一个吸收峰的极值,若这个吸收峰的极值相对应的波长大于529nm,则反时针方向调节波长调节螺杆,使这个极值相对应地靠近529nm,一直调到波长误差在允许范围内(5292nm);
反之,吸收峰极值相对应的波长小于529nm,则顺时针方向调节螺杆。
2.红蛋白及衍生物吸收光谱测定(见书)
分光光度计的使用
1.开电源开关,打开箱盖,预热10mins
2.将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿
(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁。
3.选定波长
4.打开箱盖(光路开关自动关闭),用空白管调
T=0
5.盖上箱盖(光路开关自动打开),再用空白管调
T=100%(若调不到,则可调节灵敏度开关)
6.将选择开关旋至A,此时显示数值应为0,否
则调节“消光零”旋钮调至0。
7.逐步拉出试样架拉手,读取各管吸光度值A。
8.全部测定结束后,取出比色皿(洗净),关闭开关。
二、电泳技术
电泳
Electrophoresis
一、定义
电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。
电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。
二、电泳分析技术发展概况
1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。
他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。
他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。
从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。
1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。
30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:
即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“LastCheck”。
由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。
三、电泳分析技术的分类
1.根据被分离样品的量多少
分析电泳
制备电泳
2.根据电泳电压的高低
常压电泳0~500V
高压电泳500~3000V
3.根据电泳中是否使用支持物
自由电泳—不使用支持物,在溶液中进行。
区带电泳—使用支持物
(1)按支持物的物理性状不同,可分为
①滤纸及其他纤维薄膜电泳,如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维
②凝胶电泳,如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳
③粉末电泳,如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳
④丝状电泳,如尼龙丝、人造丝电泳
(2)按支持物的装置形式不同,可分为
①平板式电泳
②
垂直板式电泳
③垂直柱式电泳
4.根据电泳系统pH是否连续
▪连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变,如滤纸电泳、醋纤膜电泳
▪不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH,如PAGE、IFE
优点是在不同pH区之间形成高的电位梯度区,使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。
电泳技术的特点:
▪凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;
▪样品用量极少;
▪设备简单;
▪可在常温进行;
▪操作简便省时;
▪分辨率高.
电泳技术应用
▪基础理论研究;
▪临床诊断;
▪工业制造.
双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能.
四、电泳的基本原理
▪一个质点,如能解离或能吸附带电质点,在电场中便会向正极或负极移动。
▪电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,