酶的发酵生产文档格式.docx

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四.酶的活力测定

一.酶（enzyme）的概念

1.酶是催化剂（catalyst）

所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。

酶在化学反应中就是充当这样的角色。

2.酶是一种特殊的催化剂

3.酶是生物催化剂

酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。

其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。

（1）酶具有催化的高效性

酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。

如：

2H2O22H2O+O2

该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：

5.6×

10-4mol/molFe+.S、

6.0×

10-1mol/mol血红素.S、

3.5×

106mol/mol过氧化氢酶.S

（2）酶具有催化的高度专一性（specificity）

酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。

酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：

a.绝对专一性：

酶只能催化一种反应物发生反应的特性

谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。

b.相对专一性：

酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。

酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。

淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。

c.异构专一性：

酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。

延胡索酸（反丁烯二酸）酶只专一催化于L-苹果酸和反丁烯二酸，兼具立体异构与顺反异构专一性。

（3）酶的化学本质是蛋白质

酶的化学本质是蛋白质，主要从以下几个方面来认识：

a.酶的化学本质是蛋白质的依据

b.结合有辅助因子的酶中，蛋白质是其高效和高度专一催化特性的主导因素

c.RNA性质的生物催化剂的发现，并未否定“酶的化学本质是蛋白质”的结论

ⅰ.酶与蛋白质一样是高分子胶体物质，且为两性电解质。

ⅱ.导致蛋白质变性的因素，如酸、碱、热、紫外线以及其他蛋白变性剂，也能使酶失活

ⅲ.酶也能被蛋白水解酶水解而失去活性。

ⅳ.对高纯化的酶进行组成分析，表明其或者是单纯蛋白，或者是蛋白质与其他小分子物质构成的络合物（即结合蛋白）。

ⅴ.根据核酸酶（RNase）的一级结构，人们已经从氨基酸开始，人工合成了具有催化活性的蛋白质产物。

ⅰ辅助因子：

通常是小分子物质，与酶结合在一起，共同完成酶的催化过程。

包括辅酶和活化剂两种类型。

ⅱ辅酶与活化剂的区别：

ⅲ辅酶也具催化力，但其催化效率和专一性都较酶差。

血红素是过氧化氢酶的辅酶，但其催化效率是过氧化氢酶的百万分之一；

磷酸吡哆醛是转氨酶的辅酶，但其可以催化L-谷氨酸的转氨基、脱羧以及异构为D-谷氨酸等多种反应。

综上，在酶的化学组成中，虽然有除蛋白质以外的其他成分，但是，蛋白质仍然是酶高效和高度专一催化特性的主导因素。

ⅰRNA性质的生物催化剂的发现:

70年代末~80年代初期，由于某些发现，使“蛋白质是酶的化学本质”的观念受到强有力的冲击。

此后，又有许多类似的报道。

所有的事实都说明：

某些RNA的确具有催化活性。

为了和蛋白质性质的生物催化剂-------酶（enzyme）相区别，Cech等将他们发现的RNA性质的生物催化剂称为ribozyme。

其中几个典型的事例如下：

ⅱRibozyme发现的生物学意义：

Ribozyme的发现是现代生物学中的一个重大突破，其意义主要表现在以下几点：

①它表明RNA除了作为遗传信息的载体外，还可能有其他的生物学功能。

②它表明除了蛋白质性质的生物催化剂-----酶以外，还可能存在其他类型的生物催化剂。

③为分子生物学研究，尤其是RNA研究提供了一种新的工具，新的思路。

④为探索生命起源提供了一种新的、重要的信息。

ⅲRibozyme的发现并未否定“酶的化学本质是蛋白质”

①目前已知的酶，基本上都是蛋白质性质的，或是以蛋白质为主导核心成分。

♦酶是蛋白质性质的生物催化剂，并不排斥还存在其他类型的生物催化剂。

Enzyme和Ribozyme是两个并列的概念。

（1）所有的酶都是生物体产生的，几乎所有的生物体都能合成酶。

（2）酶和生命活动密切相关，主要表现在

a.酶参与了体内所有的生命活动和生命过程

b.酶组成分布是生物进化与组织功能分化基础

c.酶在多种水平上可调节以适应生命活动的需要。

综上，对于酶，可以有如下概念

酶是一种由生物体产生的，具有高效和高度专一催化活性的，与生命活动密切相关的蛋白质性质的生物催化剂。

1.我国古代劳动人民积累了丰富的酶学经验，为后来酶的研究做出了贡献

2.近代酶研究的历史概况

3.现代酶学研究发展的方向

真正系统的对酶的认识和研究应从十九世纪开始，其中许多重要的事件标志着酶研究的进程。

（1）1833年Payen和Persoz从麦芽抽提物中，用酒精沉淀得到了一种热不稳定的活性物质，他可促使淀粉水解为可溶性的糖。

他们将这种物质称为淀粉酶（diastase）。

（2）19世纪中叶，巴斯德等对酵母的酒精发酵进行研究，指出酵母中存在一种能使葡萄糖转变为酒精的物质。

（3）1878年库尼首次提出酶的概念，将这种在酵母中使葡萄糖转变为酒精的物质称为酶（enzyme）。

Enzyme这个字来自希腊文，意为“inyeast”（在酵母中）。

（4）1896年，巴克纳兄弟发现酵母无细胞抽提液，也能将葡萄糖转变为酒精。

表明酶不仅胞内也可在胞外起催化作用。

由此，酶的研究开始在化学研究已建立的基础上进行。

（5）1894年，EmilFischer通过对糖代谢中一些酶的研究，发现了酶作用的专一性。

提出了“锁钥学说”，来解释这种专一性。

（6）1913年Michaelis和Menten提出了中间产物学说，推导出了米氏方程。

（7）1926年，Sumner获得了第一个结晶的酶，即脲酶，并证明他具有蛋白质性质，提出了酶的化学本质是蛋白质的观点。

（8）1960年测出了核糖核酸酶的氨基酸顺序；

1965年用x-射线技术推测了溶菌酶的三维结构，同时提出了酶作用机制的许多理论。

（9）1958年Koshland提出了诱导契合理论，解释酶的催化机制和专一性；

1961年Monod及其同事提出了变构酶模型。

（10）1969年首次Gutte和Merrifield由氨基酸单体化学合成具有活性的牛胰核糖核酸酶。

（11）1982年，Cech等发现了具有催化作用的RNA（Ribozyme）。

（12）1986年，Pollack等用预先设计好的某酶过渡态类似物为半抗原，免疫动物以后，制得可与该抗原相结合的抗体，该抗体具有催化活性，称为抗体酶（Abzyme）。

抗体酶的出现，为酶结构与功能研究以及酶的应用等方面都开辟了一个全新的领域。

（1）夏禹时代（距今约四千多年），我国古代劳动人民已能酿酒。

酒即是酵母发酵的产物，是细胞内酶作用的结果。

我国古代所言的酒母和曲，就含有大量的酵母和丰富的酶。

（2）约三千多年前，我国劳动人民就已能制饴糖（麦芽糖），这就是利用麦曲含有的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖。

（3）约公元十世纪，我国劳动人民已能用豆类制酱，豆酱主要是利用霉菌蛋白酶将豆类蛋白质水解所得的食品。

将其压榨以后，可得酱油。

现代酶学研究主要沿着两个方向发展

（1）酶的分子生物学方向：

其主要任务是要从分子水平上更深入揭示酶结构与功能的关系；

酶催化机制和调节机制；

酶与生命活动的关系等理论问题，进一步设计酶、改造酶、在基因水平上进行酶的调节控制。

（2）酶工程方向：

其主要任务是研究如何经济有效地进行酶的生产、制备、应用，将基因工程、以及分子生物学的最新研究成果用于酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器等。

三.酶的分类与命名

1．酶的分类

酶的种类很多，目前发现的酶约有3700多种，为了更好地研究酶、应用酶，国际酶学委员会推荐了酶的分类系统，该系统根据酶的催化作用类型，将已知酶为六大类：

（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases）

（2）转移酶类（Transferases）

（3）水解酶类（Hydrolases）

（4）解合酶类（Lyases）

（5）异构酶类（Isomerases）

（6）合成酶类（Ligases或Synthetases）

例2催化D-已糖磷酸化为D-已糖-6磷酸反应的酶

习惯命名：

已糖激酶（hexokinase）

系统命名：

ATP：

D-已糖6-磷酸转移酶

（ATP：

D-hexose6-phosphotransferase）

3．酶的标码

为了更简便清楚地识别每一种酶，国际酶学委员会对每一个酶都用4个数字进行编码，称为酶的标码。

醇脱氢酶，标码为EC1.1.1.1

已糖激酶，标码是EC2.7.1.1

其中EC代表酶委员会系统（EnzymeCommission），前三个数字分别表示酶所属的大类、亚类、亚亚类，根据这三个数字，可以判断出酶的催化类型和性质。

第四个数字表示该酶在亚亚类中占有的位置，有了这四个数字，就可确定具体的酶。

四.酶的活力测定

1．酶活力的含义

酶活力是指在一定条件下，酶所催化的化学反应进行的速度。

反应速度越大，意味着酶活力越高。

2．酶的活力测定

3．酶的活力单位

4．固定化酶的活力测定

测定酶活力，就是测定酶所反应的速度，并且是初速度。

（1）酶反应速度：

指单位时间内底物的减少量或产物的增加量。

V＝ds/dt＝dp/dt

（2）测定方法：

酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速、简便，准确。

酶活力测定主要包括两个阶段:

其一，酶与其作用底物反应一段时间；

其二，测定反应液中底物或产物变化的量。

酶活力测定的一般步骤：

a.根据酶的专一性，选择适宜的酶反应底物。

b.根据资料或试验结果，确定酶促反应条件。

c.在适宜条件下，进行酶反应，记下反应时间。

d.反应一定时间后，终止反应，立即测定产物的生成量或底物的减少量。

终止酶反应的方法有：

①反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；

②立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活；

③加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应；

④将取出的反应液立即置于冰粒堆中，或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至o℃以下等等。

测定反应液中物质变化量的方法：

①光学检测法：

用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸（NPP）水解生成的对硝基酚的量。

②化学检测法：

用