一株沼泽红假单胞菌的分离鉴定及应用研究Word格式文档下载.docx
《一株沼泽红假单胞菌的分离鉴定及应用研究Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株沼泽红假单胞菌的分离鉴定及应用研究Word格式文档下载.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
VOTO1-G，wasisolatedfromriversedimentmainlyreceiveddomesticwastewater．The
VOTO1-Gbacteriawasresearchedaboutitsgrowthlaw，andidentifiedbymolecular
biologymethod，andfurtherusedtotestitsabilityintheremovingofnitrogen，phosphorus
andorganiccompoundfromeutrophicwaterby0.05‰，0.1‰and0.2‰．ResultsBy
checkingtheindividualmorphology，colonyculturecharacteristics，DNAsequencingand
16SrDNAgenebank，VOTO1-GwasidentifiedasRhodopseudomonaspalustris．The
isolatedbacteriastrainhadsomenitrogen，phosphorusandorganiccompoundremoval
ability．ConclusionOnestrainofphotosyntheticbacteriawassuccessfullyisolatedfrom
sewagesediments．Itsremovalcapacityofnitrogen，phosphorusandorganiccompound
fromeutrophicwaterwasgood，whichremovedCOD12%，TP25%，TN13%．
Keywords:
photosyntheticbacteria，Rhodopseudomonaspalustris，eutrophication，
riversediment，eutrophicwater第6期王琳，等.一株沼泽红假单胞菌VOTO1-G的分离鉴定及应用研究939
近年来，国内外关于光合细菌去除水体中营
养物质的报道很多
［1-5］
，主要集中在发展生物脱
氮除磷的新工艺和新概念
［6-7］
、菌株选育
［8-10］
等方
面。
在菌种的选育方面，虽然已经发现了多种不
同类型的光合细菌，但是不同光合细菌的脱氮除
磷能力不同。
如何获得高效的降解菌株以及如何
使其成为反应体系中的优势种群而发挥更好的脱
氮除磷效果仍然是研究的热点。
本试验从受纳生
活污水的河流沉积物中分离、筛选光合细菌高效
降解菌株，并采用形态学特征、分子生物学等多种
方法进行鉴定，为研究其在富营养化水体中的脱
氮除磷性能和相关污水的处理提供微生物基础。
1材料与方法
1.1富集培养
北京市清河主要是生活污水的受纳水体，氮、
磷含量很高，其中总氮浓度（TN）为9.46mg/L（以
N计），总磷浓度（TP）为0.96mg/L（以P计）。
取
清河的底泥100g装入透明的玻璃圆桶标本缸内，
与1000ml光合细菌液体富集培养基搅拌均匀，然
后在标本缸上层加入液体石蜡以隔绝空气，在
（25～35）℃下，以4000lx光照强度培养2周。
用
无菌滴管从光合细菌生长良好的圆桶玻璃标本缸
内壁处，吸取红色细菌和污水水样5ml，移植到无
菌试剂瓶中，加入灭菌后的富集培养液，加上橡皮
塞，造成厌氧状态，继续光照，厌氧培养时保持
（25～35）℃，试剂瓶中菌液的颜色逐渐变红。
待
生长良好后，再按上述同样步骤转接3次，至试剂
瓶中菌液成棕红色，红螺菌科细菌占优势。
红螺
菌科分离培养基:
NH
4
Cl0.1g，MgCl
2
0.02g，酵母
膏0.01g，K
HPO
0.05g，NaCl0.2g，琼脂2g，蒸馏
水90ml，0.1MPa灭菌20min。
灭菌后，无菌操作
加入经过滤除菌的0.5g/5mlNaHCO
3
;
再无菌加
入过滤除菌的0.1gNa
S·
9H
O;
最后再加5ml
经过除菌的4%丙氨酸。
用过滤灭菌的0.1mol/L
H
PO
调pH至7.0。
红螺菌科富集培养基:
Cl0.1g，NaHCO
（5%NaHCO
水溶液，过滤除菌取2ml加入无菌
培养基中）0.1g，K
0.02g，CH
COONa
0.1g，MgSO
·
7H
O0.02g，NaCl0.05g，生长因子
（维生素B
1
0.001mg、尼克丁酸0.1mg、对氨基苯
甲酸0.1mg、生物素0.001mg，以上药品溶于蒸馏
水中，定容至10ml，然后过滤除菌）1ml，蒸馏水
97ml，微量元素溶液（FeCl
6H
O5mg、CuSO
5H
O0.05mg、H
BO
1mg、MnCl
4H
O0.05mg、
ZnSO
O1mg、Co（NO
）
O0.5mg，以上
药品分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml）1ml，
pH7.0
［11］
。
除NaHCO
、生长因子和微量元素溶
液外，各成分溶解后0.1MPa灭菌20min，然后再
分别加入NaHCO
、生长因子和微量元素溶液。
1.2分离纯化
分离用固体培养基:
在液体培养基中加入
2%的琼脂，其他成分不变。
将已融化并冷却至（45～50）℃红螺菌分离
培养基倾倒平板;
再用已经过过滤除菌的0.05%
抗坏血酸溶液对富集培养的红螺菌科细菌菌悬液
适当稀释;
以涂布分离法将稀释的红螺菌科细菌
菌悬液在平板上，然后再倒入（45～50）℃红螺菌
分离培养基，造成厌氧环境，（25～35）℃，4000lx
光照下培养。
待棕红色菌落出现后，挑单菌落在
2ml液体富集培养基中进行扩增培养。
重复上述
操作，反复进行涂平板挑单菌落，直至获得纯菌
种。
同时保存纯菌种:
（1）液态保存:
将液体培养
基灭菌后接入菌种，经光照培养后，置于4℃冰箱
中，以后每隔30天转接一次;
（2）固态保存:
制备
固体培养基，挑取较大的菌落穿刺接种，经光照培
养后用液体石蜡封口，用黑布包裹后，置于－70℃
下，每隔一年转接一次
［12］
1.3菌种的生长规律试验
在菌种筛选试验的基础上，对获得的菌种进
行细胞生长测定及其生长规律的试验研究。
在光
合细菌的富集培养基中按20%的接种量接种，在
30℃光照培养箱中培养，每天同一时间取3个重
复于波长600nm处，测其吸光度（A值），以便将
菌体培养到对数生长期的初期或在对数生长期到
稳定期之间。
1.4菌种的鉴定
对所筛选到的菌株进行鉴定，通过观察菌落
形态、显微镜下菌体形态观察、革兰染色、16S
rDNA扩增以及DGGE等分子生物学手段相结合
的方法进行了菌株的鉴定等，依照微生物学细菌
分类鉴定实验方法，对获得的菌株进行初步鉴定。
1.5DNA提取及PCR-DGGE技术
1.5.1样品准备和细菌DNA提取取分离纯菌
株的液体培养液于8ml离心管中，8000r/min，
4℃，离心20min，弃上清液，取沉淀，加入0.5ml
DNA提取缓冲液（1mol/LTris-HCl，pH8.0）备
用。
单菌株DNA的提取采用BenzylChloride
方法
［13］
1.5.2PCR扩增PCR扩增采用AmpliTaq
Gold
TM
反应系统（PerkinElmer，AppliedBiosyst-
ems，NJ，USA）。
引物为357F和517R，它们的序940卫生研究第41卷
列分别为5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，5’-
ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
PCR的反应程序:
95℃10min;
下面的程序进
行25个循环，93℃1min，50℃1min，72℃1min
30s;
之后，93℃1min，50℃1min，72℃5min。
反
应体系（50μl）:
1μldNTP（10mmol/L）、5μl10×
PCRGoldBuffer、4μlMgCl
（25mmol/L）、0.5μl
357F（45pmol/μl）、0.5μl517R（45pmol/μl）、1μl
模板DNA（10ng/μl）和0.5μlTaq酶（2U/ml），其
余体积用无菌水补充。
PCR产物以2%琼脂糖凝
胶电泳检测，经纯化后送测序公司测序，所获得的
DNA序列与BLAST程序的数据库序列比较，确
定菌株的分类地位。
1.5.3D
升级会员 