神经细胞培养讲义PPT格式课件下载.ppt

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研究的费用相对比较经济7）：

可作为一些遗传物质的运载细胞8）：

干细胞的广泛应用前景3组织或细胞培养的不足：

1）与体内条件存在差异；

2）细胞培养存在一定的不稳定性4培养细胞的特性1）培养细胞生长方式：

a贴附生长型细胞（大多数）b悬浮生长型细胞（少数）2）培养细胞生长特点：

贴附；

接触抑制；

密度依赖性5培养细胞生长的条件1）细胞的营养需要：

a基本营养物质：

氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子；

b营养因子等物质2）细胞的生存环境：

a温度：

哺乳动物和人类为3537；

鸟类为38.5b气相及PH值：

O2及CO2的值：

CO2=5%；

PH=7.27.4c渗透压：

260320mmol/L3）无污染及无毒：

体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！

无毒：

与细胞直接接触者培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等；

间接接触者配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等无污染：

微生物及交叉污染6常用的培养用液及培养基培养用液：

水平衡盐溶液（）（见表）消化液胰蛋白酶液（%）二乙烯四乙酸二钠（）胶原酶培养基：

天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）合成培养基（SF12（）等常用的平衡盐溶液（g/L）第二节：

神经细胞体外培养的基本概念和方案神经细胞培养的类型1神经细胞的原代培养原代培养（primaryculture）：

指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养传代培养（subculture）：

当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。

2细胞系培养一神经元的原代培养（Primaryculture）一、组织来源：

1）种属：

大鼠小鼠家鸡瓜蟾海兔蜗牛水蛭等2）年龄：

一般为胚胎或新生动物组织神经胶质细胞：

生后早期蒲肯野细胞：

胚胎末期颗粒细胞：

生后两周以内主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养二、常用试剂1）培养液ADMEM：

BF12培养液CDMEM/F12培养液D无血清培养液加神经营养因子2）D-Hank液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS）3）聚L-赖氨酸：

处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10min4）神经营养因子：

睫状神经营养因子（ciliaryneurotrophicfactor,CNTF）:

支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活；

脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF）:

支持外周和中枢特殊细胞群体的神经细胞；

硷性成纤维生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）等三、培养操作过程新生13dSD大鼠，麻醉后75%酒精浸泡消毒，断头后移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37培养箱，定期振摇促消化。

消化约20min，用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min，吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1106/ml细胞悬液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放置0.80.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37培养。

四、神经元的鉴定：

神经元特异性烯醇化酶（NeuronspecificenoloseNSE）、微管相关蛋白（MicrotubuleassociatedproteinMAP2）神经元,五、神经元的纯化：

胞嘧啶阿拉伯糖，培养两至四天后用含510mol/L胞嘧啶阿拉伯糖的培养24hour,然后改用常规培养液。

培养过程中注意事项1）培养底物的处理：

多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸细胞外基质成分（胶原）细胞黏附分子单层非神经细胞单层的胶质细胞2）胰蛋白酶的作用时间：

3）细胞合适的换液时间：

大脑皮质不用经常换液海马神经元应半量换液胶质细胞经常换液六、神经元的观察：

刚分离出的神经元呈圆形，用倒置显微镜观察有明显的光晕。

接种一般在2-6小时可贴壁；

8小时已有纤细有突起长出24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或椭圆形。

生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为主培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态多样，有些具有分枝的突起，培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光滑的胞体，发育良好的突起。

MAP-2ABNSEstainneuronTHstainneuronConfocallaserscanimagesoforgantypicsliceculturefromavianhippocampusSliceculture.Luciferyellowstain（bar50m）N运动神经元Dil标记Purkinjecellinculture（PEP-19）二、胶质细胞的培养胶质细胞纤维性的分类：

a大胶质细胞星形胶质细胞原浆性少突胶质细胞b小胶质细胞周围神经系统主要是施万细胞研究胶质细胞的方法1）从未成熟的脑组织分离、培养获得大量胶质细胞2）已经开发出能识别胶质细胞的免疫学标志物。

根据免疫组化反应分类：

型星型胶质细胞和型星型胶质细胞：

标志物检测对象型细胞类型型少突胶质细胞形态多角型星型具有少量突起A2B5多聚唾液酸神经节苷脂+GFAP胶质纤维酸性蛋白+Ran-2大鼠神经抗原-2+GC半乳糖脑苷脂+GD3GD3神经节苷脂+3H-GABAGBBA摄取+125I-CYP-肾上腺能受体+NG2300kDa蛋白聚糖+J1细胞黏附分子+Ia型MHC抗原+利用细胞培养可研究胶质细胞的特性受体的表达神经营养因子的分泌酶的诱导、蛋白质的合成神经递质的摄取髓鞘的形成神经的局部免疫反应代谢过程胶质细胞培养的局限性1大多来自于未成熟大脑，所以不能达到与体内相一致的成熟程度，成年可能有干细胞的存在。

其形态可能随培养条件而发生变化。

2存在不同的细胞亚群3其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用。

培养用液培养基：

MEM400ml+血清45ml+GLU-谷氨酰胺青链霉素溶液8ml葡萄糖-谷氨酰胺青链霉素溶液（100ml）：

葡萄糖30g；

谷氨酰胺100mmol/l；

青霉素2.5X105U;

链霉素2.5X10g胰蛋白酶：

0.25%培养的方法：

1）取材生后1天的大鼠，75%酒精消毒，断头，置于培养皿中2）沿纵轴剪开皮肤和颅腔，取出大脑皮质，去除嗅球等3去除脑膜，洗涤（Hanks液）4）组织剪成碎块，37缓慢振荡约10min。

5）重复过滤数次，收集细胞悬液，调整细胞密度104106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱培养（或者6）移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单细胞悬液7）加入完全培养基终止8）接种3天后换液，以后每两天换液9）传代,0.25%胰蛋白酶消化（覆盖细胞层即可）或着用摇晃的方法传代时注意事项：

a细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分表面以前，不要急于传代b注意观察不同细胞有不同的消化时间；

动作要轻柔，避免损伤细胞c首次传代时细胞数量要多一些，使细胞尽快适应新环境鉴定：

星形胶质细胞鉴定：

胶质原纤维酸性蛋白（GlialfibrillaryacidproteinGFAP，A2B5）少突胶质细胞鉴定：

GalC（-galactosidase）神经胶质细胞分离和纯化流程第0-12天大鼠脑皮质混合细胞培养第12天预震荡（260rpm，1.5h）收获非贴壁细胞震荡（260rpm，18h）第13天贴壁的扁平细胞富含型星型胶质细胞37培养1h收获贴壁细胞富含小胶质细胞非贴壁的，有突起的细胞，（前体细胞）富含型星型胶质细胞含10%胎牛血清培养富含少突交质细胞化学限定培养其他可选择的分离培养方案1低密度接种培养获得型胶质细胞原理：

在低密度时神经元和产生型胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞不能存活优点：

简单缺点：

1）仅能获得型胶质细胞2）成纤维细胞增殖能力更强3）部分型胶质细胞体积变大2利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获得3小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好污染细胞的去除污染细胞的去除1成纤维细胞的污染：

为型星型胶质细胞主要污染细胞（用抗纤维结合素（fibronection）的抗体鉴别）1）预防为主；

取材小于两天鼠，脑膜驱除干净，2）用D-缬氨酸代替培养基中L-缬氨酸2小胶质细胞的污染：

预震荡的方法可以驱除大部分小胶质细胞，或者在培养液加入5mmol/l的L-亮氨酸甲酯，两小时后可杀死小胶质细胞。

3少突神经胶质细胞的污染：

1）含血清培养；

2）在传代培养时用抗半乳糖脑苷脂抗血清或补体处理GFAPhumanSchwanncells细胞系的生长过程：

有限细胞系：

原代培养传代期衰退期无限细胞系：

滞留期指数增长期平台期三、三、神经细胞系培养神经细胞系培养有限细胞系无限细胞系指数细胞数量培养时间（周）原代培养细胞系阶段神经肿瘤细胞系培养优点优点：

容易生长、增殖速度快、实验操作简单等优点；

可以用液氮长期保存；

培养条件标准化；

可以导入外源基因；

缺点缺点：

不能表现出神经元分化的许多过程，不能植入人体。

神经细胞系的建立：

1）动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养（PC12）2）将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分离的细胞融合。

3）利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞，使神经细胞获得永生。

Neuroblastomacellsonglassslide原始数据图，颜色表示荧光强度Neuroblastomacellsonsiliconwafer硅片Ra=20nm神经母细胞瘤细胞生长密度很高细胞膜电位正常活性很高Rh-123染色荧光照片100X神经母细胞瘤细胞贴附良好，开始分化并且形成网络大鼠嗜铬细胞瘤株PC12的培养PC12细胞；

来源于大鼠嗜铬细胞瘤克隆，其具有嗜铬细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞相关的表型。

可以合成儿茶酚氨，在有NGF的作用下细胞停止增殖，生长出神经突起等特点。

优点：

1）相当高的稳定性和同质性2）分化程度高，对NGF有很强的反应3）已经具备了PC12细胞的生物学特征的背景资料所以常被广泛用于神经细胞分化和功能的研究一、PC12细胞的常规培养1）培养液：

85%RPMI1640培养液、10%马血清、5%胎牛血清，也可用DMEM或F122）培养的底物：

PC12细胞对塑料和玻璃黏附能力较差，所以必须在培养前进行底物处理：

胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等PC12细胞的培养和传代1）PC12细胞增倍时间为2.54天实际可7-10天传代一次。

2）传代比例为1：

3或1：

43）换液时间为2-3天每次换液约为2/3的培养液4）通过机械分离进行传代培养-用吸管轻轻吹打5）必须选择生长在胶原或着其他底物的细胞群体进行传代PC12细胞的冻存和复苏PC12细胞可长期冻存保种过程：

细胞吹打从培养皿脱落，离心收集，并悬浮与10%DMSO的完全培养液中，用冻存管分装细胞悬液，放入-80C过夜达6个月。

长期冻存可放置于液氮罐中。

复苏：

37C水浴中快速复温，离心漂洗去除冻存液后重悬浮于完全培养液。

PC12细胞培养常出现的问题1）细胞生长不良血清问题或密度过低2）细胞贴壁不良3）对NGF反应不良细胞群体变异、NGF失活神经生长因子（NGF）的处理