基因工程的基本操作程序教学课件优质PPT.ppt

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原核细胞的基因结构编码区下游编码区下游非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游启动子启动子终止子终止子补：

真核细胞的基因结构补：

真核细胞的基因结构内含子内含子外显子外显子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游编码区下游编码区下游RNA聚合酶的聚合酶的始结合位点始结合位点RNA聚合酶的聚合酶的末结合位点末结合位点结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：

内含子：

外显子：

（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）

（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）1.基因文库基因文库基因文库基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNAcDNA文库）文库）u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因，而是中不是直接保管相应基因，而是保存保存受体菌受体菌，菌中含基因。

，菌中含基因。

将含有某种生物不同基因的将含有某种生物不同基因的许多许多DNADNA片段片段，导，导入到入到受体菌的群体受体菌的群体中中储存储存，各个受体菌分别含，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

有这种生物的不同基因，称为基因文库。

基基因因组组文文库库的的构构建建模模式式图图部部分分基基因因文文库库的的构构建建模模式式图图基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文库类型文库类型文库类型文库类型cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少基因多少基因多少物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流物种间基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分某种生物的部分基因基因某种生物的全部某种生物的全部基因基因可以可以部分基因可以部分基因可以解旋酶催化解旋酶催化1）解旋解旋模板模板2）合成互补子链合成互补子链以母链为模板进行以母链为模板进行碱基配对碱基配对（在在DNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行利用游离的脱氧核苷酸进行）母链（旧链）母链（旧链）子链子链（新链）（新链）子代子代DNA:

同时进行同时进行（边解旋边复制边解旋边复制）组成组成3）形成新的形成新的DNA分子分子补：

补：

DNA复制过程复制过程：

作用：

把单个脱氧核苷把单个脱氧核苷酸连接成链酸连接成链（形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键）2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：

概念：

PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。

的核酸合成技术。

2原理：

原理：

DNADNA复制复制原料：

原料：

模板模板DNADNA；

DNADNA引物；

四种脱氧核苷引物；

四种脱氧核苷酸；

热稳定酸；

热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3前提：

前提：

已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程aa、DNADNA变性变性（90-9590-95）：

）：

双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_bb、退火、退火（复性复性55-6555-65）：

系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。

cc、延伸、延伸（70-7570-75）：

在）：

在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。

氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：

每重复一步骤：

每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一PCR技术的操作过程PCR技术的操作过程PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数（2（2nn）形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋边复制边解旋边复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、聚合酶、解旋酶等解旋酶等n过程：

过程：

变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：

变性：

9095退火：

退火：

5560延伸：

延伸：

70753.人工合成法利用利用DNADNA合成仪人工合成的前提：

合成仪人工合成的前提：

基因较小，核苷酸基因较小，核苷酸序列已知序列已知蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考：

思考：

化学法合化学法合成的目的基因含成的目的基因含内含内含子、启动子和终止子子、启动子和终止子吗？

吗？

课堂小结11、从基因文库中获取、从基因文库中获取22、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增33、人工合成、人工合成种种类类基因组文库：

基因组文库：

含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：

部分基因文库：

只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：

如：

cDNA文库文库归纳：

获取目的基因的方法归纳：

获取目的基因的方法思考：

为什么要构建思考：

为什么要构建基因表达载体？

基因表达载体？

（11）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并并可以遗传可以遗传给下一代；

给下一代；

（22）使目的基因能够）使目的基因能够表达表达和发挥作用。

和发挥作用。

二、构建二、构建表达表达载体载体思考：

作为基因工程表达载体，作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务只需含有目的基因就可以完成任务吗？

不可以。

因为目的基因在表达载体中得到表达因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，并发挥作用，还需要有其他控制元件还需要有其他控制元件，如，如启动子、终止子和标记基因等。

启动子、终止子和标记基因等。

2.2.基因表达载体的组成：

基因表达载体的组成：

它们有什么作用？

aa、目的基因、目的基因bb、启动子、启动子cc、终止子、终止子dd、标记基因、标记基因启动子启动子：

终止子：

标记基因：

位于基因位于基因首端首端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片段，片段，它是它是RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位，有识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出了它才能驱动基因转录出mRNAmRNA。

位于基因位于基因尾端尾端的一段特殊的的一段特殊的DNADNA片段，片段，能能终止终止mRNAmRNA的转录。

的转录。

鉴别受体细胞中是否含有目的基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从，从而将有目的基因的细胞筛选出来。

而将有目的基因的细胞筛选出来。

相同点：

不同点：

载体载体与与表达载体表达载体的异同的异同都有都有标记基因标记基因和和复制原点。

复制原点。

表达载体在载体基础上增加了表达载体在载体基础上增加了目目的基因、启动子、终止子的基因、启动子、终止子三部分三部分结构。

结构。

基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶切割限制酶切割两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接连接酶连接重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端用用同一种限制酶同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶连接酶使之连接使之连接三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞

（一）转化：

（一）转化：

目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达

（二）方法

（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物植物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入动物动物细胞细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物微生物细胞细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法（11）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：

特点：

TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移可以转移到受体细胞，并整合到受体到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的细胞染色体的DNADNA上。

上。

易感染易感染双子叶植物双子叶植物和裸子和裸子植物，对大多数单子叶植植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。

物没有感染能力。

转化过程转化过程:

TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。

达的方法。

（22）基因枪法）基因枪法适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物（33）花粉通道法）花粉通道法植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。

穿过花柱直通胚囊。

花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基因）（含目的基因），使目的基因借助花，使目的基因借助花粉管通道进入受体细粉管通道进入受体细胞。

胞。

适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（11）方法：

显微注射法）方法：

显微注射法（将基因表达载体提将基因表达载体提纯，用显微仪注射到纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中中）（22）操作程序）操作程序:

提纯提纯含目的基因表达载体含目的基因表达载体取取受精卵受精卵显微注射显微注射移植移植到输卵管或子宫到输卵管或子宫受精卵发育受精卵发育新性