李淑娟-六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究西北大学硕士学位答辩PPT_精品文档PPT文档格式.ppt

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,4,融合标签技术的应用用于蛋白质纯化用于蛋白质固定用于蛋白质检测,第一部分,西北大学硕士研究生论文答辩,常用的蛋白纯化标签六聚组氨酸（6His）谷胱甘肽巯基巯基转移酶（GST）表位标签（如HA，c-myc）,利用融合标签和固相配体的相互作用,5,六聚组氨酸标签的优势6His较小，所以基本上不影响蛋白的结构和功能。

对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力。

与金属离子的结合不受变性剂（尿素、胍）的影响。

带有6His标签的融合蛋白与金属离子结合后具有温和多样的洗脱条件。

六聚组氨酸融合蛋白纯化方法金属螯合亲和层析法免疫亲和法,第一部分,西北大学硕士研究生论文答辩,6,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,金属螯合亲和层析法介绍金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose制备六聚组氨酸融合蛋白的诱导表达及细胞裂解液的制备六聚组氨酸融合蛋白纯化条件的优化Co-CM-Asp-Sepharose用于六聚组氨酸融合蛋白的大量纯化Co-CM-Asp-Sepharose与Ni-NTA-Agarose的比较,金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白纯化的研究,7,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,金属螯合亲和层析法介绍,固定化金属螯合亲和层析（IMAC）原理：

利用蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子亲合力不同对蛋白质进行分离。

金属螯合亲和介质与蛋白质的作用,8,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,金属螯合亲和层析介质组成载体：

软基质（琼脂糖、葡聚糖）、硬基质（硅胶、多孔玻璃）、膜材料（纤维素、尼龙、聚乙烯、聚砜）及磁性材料。

螯合配基：

次氨基三乙酸（NTA）、亚氨基二乙酸（IDA）、三羧甲基乙二胺（TED）及羧甲基天冬氨酸（CM-APS）。

金属离子：

Cu2+、Ni2+、Zn2+及Co2+，其中Cu2+对蛋白质结合力最强，Ni2+次之，Co2+和Zn2+结合相对较弱。

9,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,研究现状,Ni-NTA-resin（Qiagen）、Ni-IDA-resin（Novagen）、Ni-TED-resin（Activemotif）已被广泛用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化，但在纯化时会出现金属离子脱落、选择性低、蛋白结合能力弱等缺点。

为提高纯化效果，国外研究者提出以CM-APS来制备IMAC介质，得到的介质对蛋白结合能力强、选择性高、金属离子不易脱落。

目前，国内多用IDA、NTA等合成IMAC介质，而用CM-APS作为螯合配基制备IMAC介质的研究未见报道。

文献报道含镍螯合介质可与不含6His残基的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附。

10,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,研究目的及意义,研究目的：

以CM-APS为螯合配基，Co2+为金属离子制备固定化金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose，并将其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。

研究意义：

国内多用IDA、NTA等合成IMAC介质，而用CM-APS作为螯合配基制备IMAC介质的研究未见报道，本实验制备的固定化金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose，得到的介质对蛋白结合能力强、选择性高、金属离子不易脱落，填补了国内此方面的空白。

11,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,金属螯合亲和层析介质的制备,载体：

SepharoseCL-6B活化剂：

环氧氯丙烷螯合配基：

羧甲基化天冬氨酸金属离子：

Co2+,12,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,六聚组氨酸融合蛋白的诱导表达及细胞裂解液的制备,六聚组氨酸融合蛋白CD155D1和gp41的表达挑取一个重组菌的单菌落，接入10mL含Cam+,AMP+的LB培养液中，30过夜培养。

取5mL种子液转接到200mLLB培养液中扩大培养，35，180rpm，23h，至OD为0.40.6，加入IPTG至终浓度100g/mL，30，150rpm，1.5h，离心收获菌体。

细胞裂解液的制备细胞裂解液:

100mmol/LNaH2PO4,10mmol/LTris,8mol/LUrea,pH8.0）,13,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,介质用量孵育时间清洗条件洗脱液咪唑浓度,六聚组氨酸融合蛋白纯化条件的优化,14,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,介质用量,结论：

纯化200L细胞裂解液中的CD155D1蛋白需60L50%的Co-CM-Asp-Sepharose悬浮液。

不同介质用量纯化后剩余溶液及洗脱液中蛋白的SDS-PAGE分析,不同介质用量与洗脱液中融合蛋白在280nm处吸光度值的关系,1：

标准蛋白；

2：

细胞裂解液；

3-8：

介质用量分别为20,40,60,80,100,120L时纯化后的上清；

9-14：

介质用量分别为20,40,60,80,100,120L时的洗脱液,15,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,孵育时间,结论：

30min内足以结合完细胞裂解液中的靶蛋白，实验中优选的介质与细胞裂解液孵育时间为30min。

不同孵育时间下剩余溶液及洗脱液中蛋白的SDS-PAGE分析,不同孵育时间与洗脱液中融合蛋白在280nm处吸光度值的关系,1：

2-7：

孵育时间分别为10,20,30,40,50,60min时纯化后的上清；

8：

孵育时间分别为10,20,30,40,50,60min时的洗脱液,16,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,清洗条件,结论：

该介质在纯化时无需pH梯度清洗，用A液即可。

A液：

100mmol/LNaH2PO4,10mmol/LTris,8mol/LUrea,pH8.0B液：

100mmol/LNaH2PO4,10mmol/LTris,8mol/LUrea,pH6.3C液：

100mmol/LNaH2PO4,10mmol/LTris,8mol/LUrea,pH5.9,不同条件清洗介质后剩余溶液及洗脱液中蛋白的SDS-PAGE,1：

3：

纯化后的上清；

4-5：

用A液、B液、C液清洗后的洗脱液；

6-7：

用A液清洗后的洗脱液,17,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,洗脱液咪唑浓度,结论：

选用C液（pH5.9）和200mmol/L的咪唑作为系统优选的洗脱剂。

不同咪唑浓度与洗脱液中融合蛋白在280nm处吸光度值的关系,18,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,优化的条件,介质用量：

60LCo-CM-Asp-Sepharose（50%悬浮液）孵育时间：

30min清洗液：

A液洗脱液：

C液（pH5.9）和200mmol/L的咪唑,200L细胞裂解液（含CD155D1，39KD）纯化体系,19,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,Co-CM-Asp-Sepharose用于六聚组氨酸融合蛋白的大量纯化,介质体积：

1.5mL50%细胞裂解液体积：

5mL,结论：

Bradford法测定蛋白浓度并计算可知1.5mL50%的Co-CM-Asp-Sepharose悬浮液纯化得到4.6mg六聚组酸融合蛋白CD155D1（39KD），即1mL净介质可纯化分子量为39KD的蛋白6.13mg。

20,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,与Ni-NTA-Agarose的比较,结论:

Co-CM-Asp-Sepharose对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。

SDS-PAGE对Co-CM-Asp-Sepharose和Ni-NTA-Agarose纯化融合蛋白的结果比较,1：

7：

用Co-CM-Asp-Sepharose纯化后的上清；

5-6：

用Co-CM-Asp-Sepharose纯化后的洗脱液；

4：

用Ni-NTA-Agarose纯化后的上清；

2-3：

用Ni-NTA-Agarose纯化后的洗脱液,蛋白选择：

gp41,21,西北大学硕士研究生论文答辩,第二部分,小结,以SepharoseCL-6B载体，羧甲基化天冬氨酸为螯合配基，Co2+为金属离子，环氧氯丙烷为活化剂制备了金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose。

对纯化200L细胞裂解液中靶蛋白所需Co-CM-Asp-Sepharose介质用量，Co-CM-Asp-Sepharose与细胞裂解液的孵育时间，介质清洗条件及靶蛋白洗脱时所需咪唑浓度等进行了优化。

结果表明：

对200L细胞裂解液纯化体系，Co-CM-Asp-Sepharose（50%悬浮液）的优选体积为60L，最佳孵育时间为30min，洗脱液最佳咪唑浓度为200mmol/L，清洗缓冲液选用A液。

开展了从5mL细胞裂解液中放大规模纯化融合蛋白的研究，并通过Bradford法测定蛋白浓度并计算可知1.5mL50%的Co-CM-Asp-Sepharose悬浮液纯化得到4.6mg六聚组酸融合蛋白CD155D1（39KD），即1mL净介质可纯化分子量为39KD的蛋白6.13mg。

比较了Co-CM-Asp-Sepharose与Ni-NTA-Agarose（Qiagen公司）两种螯合介质对融合蛋白的纯化效果，发现Co-CM-Asp-Sepharose介质具有选择性好，清洗条件简单，得到的靶蛋白纯度高等优点。

22,西北大学硕士研究生论文答辩,第三部分,抗六聚组氨酸多克隆抗体的制备及以磁性微粒为载体六聚组氨酸融合蛋白的纯化,免疫亲和纯化法介绍抗原合成抗体的制备和纯化抗体纯化后效价测定抗6His多克隆抗体用于纯化6His融合蛋白的初步研究金磁微粒介导的多克隆抗体中抗KLH（血蓝蛋白）抗体的去除,23,西北大学硕士研究生论文答辩,第三部分,免疫亲和纯化法,免疫亲和纯化技术原理：

利用抗原抗体特异性可逆结合的特性，根据抗原抗体的高选择性，从复杂样品中提取目标化合物。

免疫亲和纯化技术应用利用固定化抗体纯化抗原1.采用活化微珠固定抗体2.蛋白A或G微珠固定抗体利用固定化抗原纯化抗体1.利用固定化抗原纯化所需抗体2.利用固定化抗原去除不需要的抗体,24,西北大学硕士研究生论文答辩,第三部分,影响免疫亲合纯化的关键因素载体选择：

理想的载体应该易活化、机械强度好，化学稳定性好、非特异性吸附低、价格低。

抗体选择：

理想的抗体是对抗原有高亲和力，与抗原结合后可被简单且温和的方法解离。

抗原的浓度：

因为使用亲和介质也有某些内在的背景限制，如果所纯化的蛋白质抗原非常少，免疫亲和纯化必须与其他方法相结合，才能获得均质性产物。

25,西北大学硕士研究生论文答辩,第三部分,研究现状,标签融合蛋白可通过抗标签的单克隆抗体和多克隆抗体来纯化。

多数免疫亲和纯化都使用单克隆抗体，目前已有商品化的特异性针对标签的单克隆抗体，但价格都比较昂贵。

两种类型的多克隆抗体可用于免疫亲和纯化，即针对合成肽（如6His、FLAG标签等）或某种抗原的特定区域产生的抗体。

在这两种情况下，由于结合到固定化抗体上的抗原位点局限在一个很小的区域，因此可实现有效的洗脱。

由于磁性微粒超强的富集和快速的分离能力、较大的