流式细胞术基本原理_精品文档PPT课件下载推荐.pptx

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科学出版社。

2010.10主要内容主要内容一、流式细胞仪结构和原理一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞术简介流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的光信号检测流式细胞术数据的存贮、显示与分析流式细胞术数据的存贮、显示与分析流式分选流式分选二、流式细胞术操作与技巧二、流式细胞术操作与技巧三、流式细胞术在生物医学中的应用三、流式细胞术在生物医学中的应用1.1流式细胞术简介流式细胞术简介流式细胞术（流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞（或生物学颗粒）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。

流式细胞仪（流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。

流式细胞术的特点流式细胞术的特点检测对象：

单细胞悬液或生物颗粒；

检测对象：

检测参数：

多参数；

检测特点：

单细胞水平分析；

检测速度：

高速，最高达上万个细胞检测速度：

高速，最高达上万个细胞/秒；

秒；

检测结果：

精度高、准确性好；

可对目标细胞进行分选；

流式：

单个细胞单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；

分析，收集每个细胞的数据，更精准；

WB：

群体群体分析，得到多个细胞的平均值。

分析，得到多个细胞的平均值。

流式细胞仪的发展及商品化流式细胞仪的发展及商品化1934Moldavanl:

Firsttry（固定式细胞分析固定式细胞分析-流动式流动式）；

1953Crosland-Taylor:

鞘流系统鞘流系统（解决难题解决难题）；

1956Coulter原理原理（血细胞计数器血细胞计数器）；

1965Kamentsky:

分光光度计定量细胞成分和散射光应用；

1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置；

等设计了细胞分选的装置；

1969Vandilla等等:

第一台荧光检测细胞计第一台荧光检测细胞计（鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光）；

1972斯坦福大学斯坦福大学:

研制出荧光激活细胞分选仪研制出荧光激活细胞分选仪（FACS）；

1973BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪式细胞仪-FACS。

1975Kohler和和Milstein:

单克隆抗体技术单克隆抗体技术（促进流式发展促进流式发展）。

1979年年国家科委重点项目：

国家科委重点项目：

研制国内第一台激光流式细胞仪；

1982年年国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；

国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；

1984年年国家科委组织科研成果的鉴定验收；

国家科委组织科研成果的鉴定验收；

1985年年获国家卫生部科技成果乙等奖；

获国家卫生部科技成果乙等奖；

1985年年-1990年年灵敏度灵敏度、信噪比信噪比、更多参数；

更多参数；

流式分选仪研流式分选仪研制开发；

制开发；

计算机四参数计算机四参数软件；

软件；

样品制备、医样品制备、医学生物学应用。

学生物学应用。

流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。

细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。

分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；

既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；

进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。

式细胞仪一般只用于分选。

BD公司分析型流式细胞仪公司分析型流式细胞仪FACSCalibur双激光四色，市场覆盖率最高LSRII双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACSCantoII双激光六色，三激光八色FACSVerse双激光六色，三激光八色BD公司分选型流式细胞仪公司分选型流式细胞仪FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBeckmanCoulter流式细胞仪流式细胞仪EpicsXL单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分选型1.2流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成液流系统液流系统流动室流动室液流驱动系统液流驱动系统光学系统光学系统激发光源激发光源光束收集系统光束收集系统电子系统电子系统光电转换器光电转换器数据处理系统数据处理系统细胞分选系统细胞分选系统喷嘴喷嘴电偏转板电偏转板样本收集器样本收集器1.2.1液流系统液流系统鞘流技术：

根据层流原理发鞘流技术：

根据层流原理发展起来的技术，可以实现两展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液（sheath）。

流体动力学聚焦：

稳定的液流体动力学聚焦：

稳定的液流从截面积较大的部分流入流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在径被约束在10-20um，避免，避免了多个细胞重叠进入检测区。

了多个细胞重叠进入检测区。

鞘液鞘液鞘液鞘液细胞流细胞流激光照射点激光照射点流体动力学聚焦示意图流体动力学聚焦示意图

（一）

（一）流动室流动室和和液流驱动系统液流驱动系统流动室流动室（flowcell,flowchamber）是流式细胞仪的核心部件。

是流式细胞仪的核心部件。

流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。

进样孔进样孔荧光信号荧光信号激光束激光束鞘液Sheath流动室结构图：

单细胞发生器流动室结构图：

单细胞发生器液流液流驱动系系统

（二）进样速率控制

（二）进样速率控制10psi10.2psi10psi10.8psi通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。

不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。

高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。

胞数就增加，这样会导致变异系数增加。

1.2.2光学系统光学系统

（一）

（一）激发光源激发光源：

激光器：

激光器气体激光器：

氩离子气体激光器：

氩离子（488nm、355nm）、氦氖、氦氖（633nm）、氪离子、氪离子（647nm）、氪氩、氪氩（568nm）；

染料激光器：

如氩离子激光泵浦的染料激光器：

如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激水溶液染料激光器，发出光器，发出550-650nm可变波长可变波长激发光；

激发光；

半导体激光器半导体激光器：

价格低、结构简单、寿命长。

BD的的FACSCalibur已采用已采用635nm半导体激光器。

半导体激光器。

激光特点：

单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。

现在仪器常配有仪器选配现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为根激光器，波长多为488nm、633nm和和355nm、405nmUV；

（二二）光光束束成成行行系系统统FCM的的单细胞照明技术单细胞照明技术：

这种：

这种椭圆形光斑椭圆形光斑的检测的检测区保区保证样证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。

本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。

细胞流动方向细胞流动方向（三）光收集系统（三）光收集系统滤光片滤光片的组成的组成长通滤片长通滤片（LP）：

只允许特定波长以上的光束通过；

：

短通滤片短通滤片（SP）：

只允许特定波长以下的光束通过；

带通滤片带通滤片（BP）：

只允许一定波长范围内的光束通过。

LongpassShortpassBandpass460500540SP500SP500LP500LP500BP500/50BP500/50460500540460500540FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统流式细胞仪信号检测系统透射光路透射光路全反射光路全反射光路FACSAria流式细胞仪器信号检测系统流式细胞仪器信号检测系统PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.2.3电子系统电子系统光电检测器光电检测器将光信号转换成电子信号。

将光信号转换成电子信号。

前置放大电路前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。

将信号等比例放大，输出电脉冲信号。

模数转换器模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。

将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。

数据处理系统数据处理系统计算机系统数据采集、分析。

计算机系统数据采集、分析。

（一）

（一）光电检测器光电检测器（photodetector）光电二极管光电二极管（photodiode）光灵敏度低，测定强信号（光灵敏度低，测定强信号（FSC）；

）；

光电倍增管光电倍增管（photomultiplier,PMT）光灵敏度高，测定弱信号（光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4）。

PMT前向散射光前向散射光光电二极管光电二极管

（二）

（二）电信号两种放大方式电信号两种放大方式由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用处理，一般信号的放大可以使用线性线性或或对数对数两种方式。

两种方式。

线性线性（linear;

lin）对数对数（logarithmic;

log）一般一般FSC和和SSC变异范围较小，故使用线性放大；

荧光信号变异范围较小，故使用线性放大；

荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。

变异范围较大，多使用对数放大。

（三）（三）电脉冲信号的面积电脉冲信号的面积A、高度、高度H和宽度和宽度WCreationofaVoltagePulseTimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0QuantificationofaVoltagePulseWidth=Area/Height光信号电信号数字光信号电信号数字信号信号通道通道（channel）一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：

倍增管，就有多少个通道：

散射光通道散射光通道:

FSC通道和通道和SSC通道；

通道；

荧光通道荧光通道通道命名方式：

通道命名方式：

以以FL（fluorescence）加数字命名，如加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。

等。

以该通道接收的主要荧光素命名，如以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。

通道等。

Forexample：

FACSCalibur有有488nm和和633nm两根激光器，两根激光