成栋学院实验指导文档格式.docx
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抗凝剂：
肝素（5µ
g/ml）
0.17M氯化钠
0.17M氯化铵
0.17M醋酸铵
0.17M硝酸钠
0.12M草酸铵
0.12M硫酸钠
0.32M葡萄糖
0.32M甘油
0.32M乙醇
0.32M丙酮
六、实验方法
（一）鸡红细胞悬液
以肝素液湿润5ml注射器内壁，推出多余的肝素液（针头内必须留下肝素液，不要进空气），取鸡的静脉血2ml左右。
取50ml小烧杯一只，加一份鸡血和十份0.17M氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。
（二）低渗溶液
取试管一只加入10ml蒸馏水，然后再加入1ml稀释的鸡血，混匀，注意观察溶液的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。
（三）鸡红细胞的渗透性
1、取试管一只，加入0.17M氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？
是否有溶血现象？
为什么？
2、取试管一只，加入0.17M氯化铵溶液10ml，再加入1ml稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？
若发生溶血，记下时间（自加入1ml稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。
3、分别在下列八种等渗溶液中进行实验，步骤同2。
（1）0.17M醋酸铵
（2）0.17M硝酸钠
（3）0.12M草酸铵
（4）0.12M硫酸钠
（5）0.32M葡萄糖
（6）0.32M甘油
（7）0.32M乙醇
（8）0.32M丙酮
七、注意事项
1．肝素用量要适宜，过少无抗凝作用，过多易导致溶血。
2．为了保证实验结果的精确性，应准确计时，并确定开始计时的标准和完全溶血的标准。
3．有的溶液不发生溶血，有的发生溶血时间比较长，可以将他们与对照组（氯化钠组）一起对比，如果发现有溶血现象但尚未完全溶血的说明该溶液可使血细胞发生溶血，只是时间未到，但是如果与对照无差别，说明它不会使血细胞溶血。
八、实验报告
将观察到的现象记录，并进行分析比较和讨论（填写表格）。
管号
处理
是否溶血
时间（单位）
结果分析
1
10ml氯化钠＋1ml稀释鸡血
2
10ml氯化铵＋1ml稀释鸡血
3
10ml醋酸铵＋1ml稀释鸡血
4
10ml硝酸钠＋1ml稀释鸡血
5
10ml草酸铵＋1ml稀释鸡血
6
10ml硫酸钠＋1ml稀释鸡血
7
10ml葡萄糖＋1ml稀释鸡血
8
10ml甘油＋1ml稀释鸡血
9
10ml乙醇＋1ml稀释鸡血
10
10ml丙酮＋1ml稀释鸡血
九、思考
1.红细胞在不同溶液中溶血时间为什么不同？
2.试述细胞膜有哪些种跨膜运输的机制？
实验二红细胞的计数
掌握动物细胞计数的方法。
细胞计数板是由特殊硬质玻璃载物片构成。
计数板的中央部分有四条沟，形成三条隆起，两边较窄的隆起，是放置盖玻片用。
中央较宽隆起部分，可有一个或两个计数室用来计数白细胞和红细胞。
中央的隆起比两边的隆起低0.1毫米，因此盖上盖玻片，在这一间隙中充满红细胞稀释液时，其深度恰好为0.1毫米。
其计数部分是由一个长3mm宽3mm深0.1mm的小室，其上被等分为9个大方格（其边长为1mm），中间的大方格又用双线等分为25个中方格（其边长为1mm/5=0.2mm），每个中方格又被单线等分为个16小方格（小方格的边长为0.2mm/4=0.05mm）。
计数时，通常选择计数室中央大方格四角和中央的五个中方格（每个中方格包含16个小格）来计数。
鸡血。
①剪刀
②玻璃毛细管
③载玻片
④细胞计数器
⑤细胞计数板和相应的盖玻片
⑥复式显微镜
①抗凝剂：
肝素（5mg/ml）。
②血细胞稀释液：
NaCl0.9g，加蒸馏水至100ml。
1、杀鸡取血，加入适量抗凝剂（取0.3ml5mg/ml肝素于试管内，可抗凝1-3ml血液）；
计数前将鸡血适当稀释（稀释100~200倍）。
2、在细胞计数板（见图1）的两条窄的隆起上涂一些液体，按住盖玻片从下方推上。
图1细胞计数板的外观
3、用玻璃毛细管吸取鸡血稀释液于放有盖片的细胞计数板的边缘，液体自然流入盖玻片下的空隙，均匀地充满计数板小室即可。
注意：
向细胞计数板加鸡血稀释液时加量要适当，过多使盖玻片漂移，过少使计数板的小室内有气泡产生，不理想时要重新滴加，否则会影响细胞计数的效果。
4、静置2~3min，待细胞稍沉降，先在低倍镜下观察红细胞是否分布均匀（见图2），如分布不均匀，就应洗后重做。
若分布均匀，则在普通光学显微镜的“10×
”物镜下进行细胞计数。
先调焦，看清计数板上的格线，然后将五个红细胞计数的中方格逐个移入视野中心，逐一计数（每一中格内含有16个小格）。
对于细胞压线者，则遵循数上不数下、数左不数右的原则。
计数后按下式计算：
鸡血红细胞数/ml血液=（5个中方格的鸡血红细胞总数/5）×
2.5×
105/ml×
稀释倍数
注：
每个中方格的体积是（0.2mm）2×
0.1mm=4×
10－3mm3=4×
10－6ml，因此：
每毫升细胞数=稀释倍数×
每个中方格细胞数/（4×
10－6）=每个中方格细胞数×
105×
图2细胞计数室示意图
1、肝素用量要适宜，过少无抗凝作用，过多易导致溶血。
2、在观察时应将显微镜的光调弱，这样有利于更加清晰的观察到计数板横竖格线。
1、鸡血红细胞计数
平均
每个中方格血细胞数
2、血细胞数/ml血液=
九、思考题
1、为什么向计数板上加血液样品要事先稀释100-200倍？
2、细胞计数板计数的原理是什么？
3、为什么要对5个中方格的红细胞计数后取平均值来计算每毫升血液中所含细胞数？
实验三红细胞的显微测量
掌握动物细胞显微测量的基本原理和使用方法
细胞的大小，一般可用显微测微尺来测量。
显微测微尺是由目镜测微尺和镜台测微尺组成的，两尺必须配合使用。
目镜测微尺是放入目镜内的一种标尺，是一特制的圆形小玻片，其上刻有50或100等分的刻度，每一刻度所代表的长度随放大倍数而改变。
因此，使用前必须测定。
镜台测微尺是在一块载玻片中央由圆形盖玻片封固的标尺，长度为1mm或2mm，分为100格或200格，每格的长度为0.01mm（10µ
m）。
其目镜测微尺的长度标定方法和细胞显微测量方法如下：
1、将镜台测微尺置于载物台的中央（注意刻度面朝上），用低倍镜调准焦距，进行观察，找到镜台测微尺的刻度。
每大格为0.1mm，每小格为0.01mm。
图1目镜测微尺和镜台测微尺外观形态
2、取下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度的一面朝下，放在镜内的光栏下，再旋上目镜的上透镜。
3、从目镜中观察目镜测微尺和镜台测微尺的刻度，转动目镜筒或移动镜台测微尺，使两标尺平行。
转换高倍镜，在视野中使目镜测微尺的任一刻度线重合为起点，沿两标尺平行方向，找到另一重合刻度线为终点，记录下其间的格数，就可以算出目镜测微尺每小格的长度。
图2显微测量原理图
公式如下：
L=10×
B/A（µ
m）
A=目镜测微尺的格数
B=镜台测微尺的格数
L=目镜测微尺每小格的长度
4、取下镜台测微尺，换上需测量的玻片标本，记录目镜测微尺所测量的标本的刻度，乘以L，即为标本的长度。
④复式显微镜
⑤目镜测微尺和镜台测微尺
血细胞稀释液：
0.9％的生理盐水9gNaCl加水至1000ml。
1、每组取1ml鸡血，用生理盐水稀释5倍，制成血涂片（方法见图5），待干燥后，先用甲醇固定2-3分钟，甩净，待干燥后，滴加姬母萨染液染色15分钟，用流水冲洗。
图3血涂片的制备方法
2、注意将被测的细胞移放到视野的中央。
为避免细胞之间的误差，需分别记录五个细胞的数据，取其平均值。
3、更换不同倍数的物镜或目镜时，需重新标定刻度。
4、根据测量结果，计算出各种细胞和细胞核的体积及核质指数。
椭圆形细胞体积：
V=4πab2/3（a为长半径，b为短半径）
核质指数：
NP=Vn/（Vc－Vn）（Vn为核的体积，Vc为细胞的体积）
2、核质指数是细胞生长状态的一个指标。
体细胞的核质比一般是一定的。
生长旺盛的细胞的核质比要比一般细胞的核质比小，卵细胞的细胞质多，核质比小。
计算鸡红细胞的体积及核质指数。
细胞长
轴直径
细胞短轴直径
胞核长轴直径
胞核短轴直径
细胞体积
胞核体积
核指指数
1、细胞显微测量的原理是什么？
2、核质比率的测量有什么意义？
3、显微测量有什么用途？
实验四动物细胞的传代培养
1、熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。
2、了解细胞传代培养的基本方法和主要操作步骤
细胞培养（cellculture）是指从机体内取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。
细胞的体外培养在细胞生物学和医学研究领域有着极为广泛的用途，这一技术已成为研究细胞生理、细胞增殖、细胞遗传、细胞癌变和细胞工程等课题的一项不可缺少的手段。
细胞培养技术的突出优点在于能为研究者提供大量的生物性状相同的细胞作为研究对象，便于人们在体外利用各种不同的方法从不同的角度研究细胞生命活动的规律。
另外，利用细胞培养技术还可使人们较为方便地研究各种物理、化学和生物因素对细胞结构和功能的影响。
细胞培养可分为原代培养和传代培养2种情况。
所谓原代培养（primaryculture）是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。
而传代培养（subculture）是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将其从原培养容器中取出，以1：
2或其他比例转移到另一
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