分子生物学大题Word下载.docx

分子生物学大题Word下载.docx

《分子生物学大题Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学大题Word下载.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

2、核酸分子杂交技术

1.Southern印迹（检测DNA）

首先通过限制性核酸内切酶降解样品中DNA，再经凝胶电泳分离，将分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素薄膜等上并固定，再用标记过的探针进行杂交，以检测目的DNA。

2.Northern印迹（检测RNA）

应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。

其方法类似于Southern印迹杂交。

3.Western印迹（检测蛋白质）

将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。

3、PCR扩增技术

1.基本原理：

DNA的半保留复制。

2.反应体系的基本成分：

（1）模板：

包括DNA和RNA。

（2）特异性引物：

是一段与模板DNA链互补的寡核苷酸片段。

（3）热稳定的DNA聚合酶：

耐热的TaqDNA聚合酶。

（4）dNTP：

包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。

（5）二价阳离子：

常用MgCl，调节DNA聚合酶活性，影响引物退火、PCR的特性。

（6）缓冲液：

一般使用Tris-Cl，调节pH值，使反应体系偏碱性；

（7）一价阳离子：

一般为KCl，促进引物退火，高浓度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性。

3.基本操作：

（1）变性将待扩增的模板DNA加热到94℃，使双链DNA解链为单链。

（2）退火将温度下降至55℃左右，引物与变性的模板DNA利用碱基互补配对结合。

（3）延伸在72℃下，DNA聚合酶在合适的缓冲溶液中，以dNTP为底物，严格按照模板链碱基序列合成互补链，即从引物的3’-OH进行循环，合成方向为5’-3’。

以上三步骤为一次循环，每循环一次，DNA分子按指数增加，经多次循环后即可达到大量扩增DNA片段的目的。

4.PCR应用：

用于目的基因的直接克隆；

将逆转录与PCR相偶联（RT-PCR），构建cDNA文库；

制作DNA探针，进行分子检测等；

用于基因表达与调控研究，如mRNA检测；

DNA的多态性分析，如通过限制性片段长度多态性来揭示DNA碱基序列的差异；

临床上进行遗传及传染性疾病的基因诊断；

在制药工业中筛选抗肿瘤的抗生素。

四、基因敲除技术

1.基因敲除的一般原理：

（1）理论基础：

同源重组，发生在两条双链DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同源DNA序列的交换。

（2）技术基础：

胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养技术。

2.基因敲除的策略：

（1）基因敲除载体构建

特点：

具有与ES细胞中目标基因同源的DNA序列；

带有选择性标记基因，便于后续的筛选和富集。

（2）基因敲除载体导入ES细胞

基因敲除载体导入ES细胞的方法：

显微注射法、电穿孔法、精子载体法、逆转录病毒法等。

（3）筛选与鉴定

基因敲除载体转染ES细胞后，大部分细胞中并没有整合入外源基因，或是发生了随机整合，因此从众多的ES细胞中筛选和鉴定出发生了同源重组的ES细胞是基因敲除的重要步骤。

常用的筛选方法有两类：

遗传筛选法，包括正负筛选法（PNS法）和正向筛选法；

物理筛选法，主要是PCR筛选方法。

（4）基因敲除动物产生

ES细胞经体外遗传修饰之后重新引入动物胚胎，可以发育产生嵌合体或完全ES细胞来源的动物。

获得基因敲除纯合体：

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

五、正负筛选法和正向筛选法

1.正负筛选法：

定义：

PNS采用置换型载体，该载体含有正（neo基因，插入载体的同源序列）和负（HSV-tk基因，置于同源序列的外侧）选择基因各一个；

同源重组时，载体的同源区发生重组，同源区以外部分将被切除，所以在同源重组时，tk基因将被切除而丢失。

而在随机整合时，所有的序列均保留。

胸苷激酶蛋白（tk）可使无毒性的更昔洛韦转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用更昔洛韦筛选排除随机整合的细胞株。

在同源重组时，细胞对G418和更昔洛韦都有抗性，随机整合时只对G418有抗性，而对更昔洛韦敏感，细胞将被杀死。

未进行任何方式整合的细胞则被G418杀死。

用G418作正筛选，可得到含有neo基因的细胞株，然后再用更昔洛韦做负筛选，淘汰含有tk基因的细胞株，就可以得到不含tk基因的同源重组细胞株。

PNS法适用于任何基因的定向敲除。

但除了产生同源重组外还可能发生随机整合。

2.正向筛选法

仅携带正选择性标记一种标记基因，而且选择性标记基因缺乏自身的某个表达调控序列。

载体转染ES细胞后，如果能发生同源重组，或随机整合入细胞基因组内并在整合位点附近恰巧存在相应的表达调控序列，那么残缺的选择性标记基因就能利用基因组上的表达调控序列得到表达；

相反的，选择性标记基因无法得到表达。

通过选择性培养基的培养，表达了选择性标记基因的ES细胞就可以被筛选出来。

正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA筛选法。

只适用于在ES细胞中能较好表达的基因。

六、基因芯片技术

基因芯片又称DNA芯片，其基本原理是将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子（寡核苷酸分子）固定于支持物上，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

2.主要步骤：

（1）芯片制备：

以玻璃片或硅胶片为载体，采用原位合成和微距阵的方法，将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。

（2）样品制备：

生物样品一般不能直接与芯片反应，须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA和RNA，然后荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。

（3）杂交反应：

样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。

选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状态中，降低错配率。

（4）信号检测和结果分析：

杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱，经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可获得有关的生物信息。

七、siRNA药物

1.定义：

小干扰RNA（siRNA）是一个长21到25个核苷酸的双股RNA，可以阻断异常蛋白的产生。

2.作用机制：

siRNA作用机制涉及RNA干扰，RNA干扰是由同源双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因沉寂，阻断基因活性的现象。

3.作用特点：

siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

4.siRNA设计应注意：

①物种特异性②靶标一般在CDS区③siRNA的转染效率

5.反义药物与传统药物的性质和作用对象明显不同，表现为:

（1）新的化学物质-核酸；

（2）新的药物受体-mRNA，DNA；

（3）新的受体结合方式-Watson-Crick杂交；

（4）新的药物受体结合后反应-如RNaseH介导的靶RNA的降解。

6.反义药物与传统药物相比具有以下优点：

（1）特异性较强;

（2）信息量较大;

（3）反义药物以核酸为靶点，与蛋白质作为靶点比较，更易合理设计新药物;

（4）比传统药物更具选择性及效率，副作用可能更少。

7.RNA干扰的作用特点

（1）具有高度特异性；

（2）具有高效性；

（3）受多基因控制；

（4）需siRNA介导：

RNAi作用的靶向精确定位是依赖于siRNA与目的基因mRNA的碱基互补配对来实现的；

（5）对靶基因位点的选择性；

（6）放大效应。

八、双向凝胶电泳技术（2-DE）

双向凝胶电泳：

利用蛋白质的等电点与分子量差异分离蛋白质。

第一向：

等电聚焦IEF，利用蛋白质等电点的不同，在pH梯度胶内进行第一次分离。

第二向：

SDS-PAGE，沿着第一向垂直的方向通过蛋白质分子量的大小进行第二次分离，把复杂的蛋白质混合物在二维平面上分离开来。

优点：

是目前常用的唯一能够在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，是目前蛋白质组学研究中最为有效的蛋白质分离技术。

缺点：

难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极小蛋白质，及低丰度蛋白质。

胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自动化联用。

九、酵母双杂交系统

基本概念：

是一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段。

它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。

典型的真核转录因子都含有二个结构域:

DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活结构域（AD）。

二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具完整活性。

将DBcDNA片段和ADcDNA片段分别与待测的X和Y蛋白cDNA片段（即Xc和Yc）结合，并分别构建在2个表达载体中，导入酵母细胞中共表达。

由DB和蛋白X形成的融合蛋白称为诱饵，由AD和蛋白Y形成的融合蛋白称为猎物或靶蛋白，被激活的、能显示蛋白X和蛋白Y之间相互作用的基因称为报告基因。

通过对报道基因表达产物的检测，可鉴定作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。

十、外源基因表达基本类型

1.根据宿主细胞不同：

原核细胞表达系统、真核细胞表达系统。

2.根据表达产物在宿主细胞生成的部位不同：

胞内表达、定位表达、分泌表达。

3.根据表达产物的溶解状况不同：

可溶性表达、包涵体表达。

4.根据表达产物的结构状况不同：

非融合表达、融合表达。

十一、外源基因表达（基因工程）的基本过程

口诀：

分、切、接、转、筛、表。

（1）分离：

提取和获得目的基因和载体DNA；

（2）切割：

分别对目的基因和载体DNA酶切；

（3）连接：

用DNA连接酶连接目的基因与载体，形成新的重组DNA分子；

（4）转化：

用重组DNA分子转化受体（宿主）细胞；

（5）筛选：

重组体在受体细胞中复制和遗传；

对转化子筛选和鉴定；

（6）表达：

对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

十二、外源基因导入的方法

1.氯化钙转化法：

将氯化钙，RNA（或DNA）混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的钙颗粒。

大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；

又称为热休克法。

2.电穿孔法：

用高电压脉冲短暂作用也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法。

3.显微注射法：

是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因。

4.阳性脂质体转染：

应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。

5.病毒感染法:

病毒介导基因转移是通过感染方式完成基因转移，即以病毒为载体,将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感