植物组织培养步骤Word格式.docx

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　　NH4NO3165gKH2PO417g

　　KNO3190gCaCl2·

2H2O44g

　　MgSO4·

7H2O37g

　　各自配成1L的母液.倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液

　　一般将微量元素配制成100倍母液.

　　依次称取

　　KI0。

083gNa2MoO4·

2H2O0.025g

　　H3BO30。

62gCuSO4·

5H2O0。

0025g

　　MnSO4·

H2O1。

69gCoCl2·

6H2O0。

　　ZnSO4·

7H2O0。

86g

　　配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

　　CuSO4·

5H2O和CoCl2·

6H2O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

5H2O0.05gCoCl2·

6H2O0.05g

　　各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

　　（3）配制MS有机母液

　　一般配制成100倍MS有机母液。

　　肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）0.01g

　　烟酸0。

05g甘氨酸0。

2g

　　盐酸吡哆醇（VB6）0。

05g

　　配成1L母液,倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。

　　（4）配制MS铁盐母液

　　一般配制成100倍MS铁盐母液。

EDTA二钠3.73gFeSO4·

7H2O2。

78g

　　配成1L母液，倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。

　　所以MS母液有5种大量元素母液,加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液,共8种母液.

　　激素母液的配制

　　各种生长素和细胞分裂素要单独配制,不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解,细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。

一般取100mg配成100ml母液。

　　2、配制培养基

　　以配置1LMS培养基为例，按顺序进行如下操作：

（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。

（2）分别取上面八种母液10ml倒入。

　　（3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

　　（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L.

　　（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。

所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差.

　　（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5。

8.（有条件的话使用酸度计，比较精确）可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

　　1当量HCL配制：

用量筒量取8。

3ml配成100ml溶液。

　　1当量NaOH配制:

称取NaOH4g配成100ml溶液。

　　（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化.

　　（8）稍微冷却后，分装入培养容器中.无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口,用橡皮筋或绳子扎紧。

　　（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

　　（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基,平放在实验台上令其冷却凝固.

二、灭菌

　　灭菌是组织培养重要的工作之一。

初学者要清楚有菌和无菌的范畴.有菌的范畴是：

凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。

依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

　　这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物.菌的特点是：

极小，肉眼看不见。

无处不在,无时不有，无孔不入。

在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单，繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。

　　无菌的范畴是：

经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。

从以上可以看出:

在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。

　　灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死.与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。

在这样的条件下进行的操作,就叫做无菌操作.

　　植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。

要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长.

　　常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即:

物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;

化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。

这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用.

　　1、培养基用湿热灭菌

　　培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序.高压灭菌的原理是：

在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。

在0。

1MPa的压力下,锅内温度达121℃。

在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

　　注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。

高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。

常用方法是:

关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。

　　关阀再通电后，压力表上升达到0。

1MPa时，开始计时,维持压力0.1—0。

15MPa，20分钟。

　　按容器大小不同，保压时间有所不同,见表。

该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大,但是放置的数量很少，也可以减少时间。

三、接种

　　接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。

接种室内保持定期用1％—3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。

除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3％的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来.无菌操作可按以下步骤进行：

（1）在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；

（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯;

　　（3）接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等;

　　（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处。

然后搽拭工作台面；

　　（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

　　（6）接种时，接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;

　　（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

　　接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。

现将接种前后的程序连贯地介绍。

　　无菌接种步骤:

（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。

如叶片切成0.5cm平方的小块；

茎切成含有一个节的小段。

微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。

在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

　　（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。

具体操作过程（以试管为例）是:

先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。

若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面.然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。

若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜.至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求.接种完后,将管口在火焰上再灼烧数秒种。

并用棉塞,塞好后，包上包口纸,包口纸里面也要过火。

四、培养

　　培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件、无菌）里,使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

　　1、培养方法

（1）固体培养法

　　即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法.是现在最常用的方法。

虽然该方法设备简单,易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。

（2）液体培养法

　　即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。

由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给,采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50—100r/min,这种定期浸没的方法，既能使培养基均一,又能保证氧气的供给.

　　2、培养步骤

（1）初代培养

　　初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系.即接种某些外植体后,最初的几代培养.初代培养时,常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。

初代培养建立的无性繁殖系包括:

茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。

根据初代培养时发育的方向可分为:

　　1）顶芽和腋芽的发育

　　采用外源的细胞分裂素，可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长,从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。

在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代,重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎.然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上,就能得到可种植到土壤中去的完整小植株.一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。

这种繁殖方式也称作微型繁殖，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。

　　适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。

　　茎尖培养可看作是这方面较为特殊