整理PCR假阳性等问题Word格式文档下载.docx
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1.样品间交叉污染：
样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；
样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；
2.PCR试剂的污染：
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3.PCR扩增产物污染：
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4.气溶胶污染：
在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染：
由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。
（三）假阳性问题的试验控制
在每次PCR检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。
阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；
阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA提取（RNA提取、RNA反转录）、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。
只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。
试验对照包括：
1、DNA阳性对照：
以含有目的片段的DNA（或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。
（注意：
阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。
2、DNA阴性对照：
以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3、空白对照：
以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4、PCR抑制物对照：
在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。
5、空白提取对照：
空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂可能受到污染。
6、阳性提取对照：
阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。
如果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。
（四）假阳性解决途径
由于PCR的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。
尤其是PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。
1、规范实验室设计
实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。
物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。
在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。
不同工作区域相互隔离，通过传递仓传递。
PCR前处理区（样品制备室、DNA提取室）和PCR准备室设置正压通风系统，并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压；
后PCR室（PCR室及电泳室为高度污染区）设置负压通风系统，防止大量游离分子及气溶胶，对其它区域造成环境污染。
配制PCR反应体系（配备冰箱及生物安全柜，此实验室要求无模板DNA存在）和向PCR反应体系中加入模板DNA（配备生物安全柜及冰箱）要求在不同区域进行。
2、规范试剂耗材管理
1）验证：
新购买的试剂需进行实验前验证；
2）分装：
双蒸水、引物和dNTP均应分装储存，并标明日期，以防污染；
试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；
试剂分装成小份一次使用后弃去。
3）消毒：
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
3、规范实验室操作
1）控制污染源：
PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源，应严格防止将这个空间的物品带出；
2）一次性用具：
使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；
3）定期消毒：
定期对实验室进行紫外照射，用10%漂白剂、3％双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。
4）定期通风：
对实验室定期进行正压、负压通风处理；
5）小心操作：
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
加样时，最后加阳性对照。
4、技术处理
1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。
一般选用波长254nm照射30min（Nature，1990，34:
27）；
2）PCR实验中使用dUTP，而不用dTTP。
在扩增前使用UraciIN一g1ycosylase（尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR产物，而不降解基困组DNA模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene，1990，93：
125）。
美国PE公司提供此类试剂盒；
3）在PCR反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联DNA链，使之不能再扩增（NucleicAcidsRes，1991，19：
99）。
二、假阴性
（一）假阴性现象与判断方法
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。
但这里应注意，许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。
设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。
在每一反应管中同时对内标准基因对照进行扩增，若内标准基因对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。
（二）造成假阴性的原因
1．仪器因素
PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。
扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败或扩增效率降低。
而离心机的影响则更容易被忽视。
国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大（有的在数倍以上），所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。
这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。
建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。
2．试剂质量问题
PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：
细胞的裂解；
模板的抽提；
引物位点的选择；
Taq酶的活性等等。
其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。
这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。
酶失活：
需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
3．核酸模板问题
1）模板中含有杂蛋白质；
2）模板中含有Taq酶抑制剂；
3）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；
4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；
5）模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
4、物理原因：
PCR仪控温不准，也是PCR失败的原因之一。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。
5、靶序列变异：
如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
6．操作人员素质问题
PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。
（三）假阴性问题的试验控制
（四）假阴性解决方案
1．反应体系不灵敏：
1）检查PCR试剂是否失效；
2）检验引物是否降解：
3）优化PCR扩增体系与程序。
2、PCR反应存在抑制物：
（1）稀释模板DNA，进行扩增分析；
（2）纯化模板DNA，除去蛋白质、多酚、多糖等抑制物；
（3）检测PCR体系中是否含有扩增抑制物。
3、DNA提取失败：
1）选择与优化样品DNA提取方法；
2）验证DNA提取试剂是否失效。
三．非特异扩增
（一）现象
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，
（二）原因：
1.引物设计与浓度
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