超氧自由基清除能力测定法-操作图解_精品文档.docx
《超氧自由基清除能力测定法-操作图解_精品文档.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《超氧自由基清除能力测定法-操作图解_精品文档.docx(2页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
超氧自由基(·O2-)的清除能力测定法(连苯三酚自氧化法)
(适用于:
SOD及各种抗氧化剂)
操作图解
具体方法
1溶液配制
1.1Tris溶液(0.1mol/L):
1.21gTris(三羟甲基氨基甲烷,M.W.121.1)+100mL蒸馏水。
1.2HCl溶液(0.1mol/L):
取0.1mL浓盐酸,加蒸馏水稀释到6mL。
1.3Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH7.4,含1mmol/LNa2EDTA)
40mL0.1mol/LTris溶液+xmL0.1mol/LHCl溶液+15.2mgNa2EDTA,混合,稀释到80mL。
用pH计测量,pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天)。
(以上为一个样品的用量)用前稍热至室温,再测pH值,符合要求即可。
1.460mmol/L连苯三酚溶液(溶于1mmol/L盐酸中)
取0.1mol/LHCl溶液(见1.2项)20μL,用蒸馏水稀释到2mL,得1mmol/L盐酸溶液(用pH计测量,pH=2.5-3.0)。
再往里加连苯三酚14.6mg(M。
W.126.1),即得。
(当天有效,以上为1个样品的用量)。
2测试液
2.1连苯三酚溶液:
取2950μLTris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中,再加约50μL连苯三酚溶液,迅速混合(颠覆式),开始计时,每隔30秒读数一次A值(325nm),至300秒(5min)时为止。
(空白参比:
Tris-HCl缓冲液)
ΔA=A325nm,300s-A325nm,30s。
由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度,所以,对于同一批实验而言,此时的ΔA值必须相等。
此时的ΔA为ΔA0。
3.2样品溶液:
取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中,再加(2950-x)μLTris-HCl缓冲液,再加50μL连苯三酚溶液,迅速混合(颠覆式),开始计时,每隔30秒读数一次(A值,325nm),至300秒时为止。
(空白参比:
Tris-HCl缓冲液)
ΔA=A325nm,300s-A325nm,30s。
此时的ΔA为ΔA样。
3计算公式
清除率=(ΔA0-ΔA样)/ΔA0*100
4注意事项
由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感,而pH值又受温度的波动而变化。
因此,实验过程中,要严格控制温度。
缓冲液宜多,比色皿用3.5mL规格。
这样数据才比较稳定。
5实验结果(以原儿茶酸为例)
采用文献[1]的改进方法,测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力,结果如图2(pH7.4)。
用旧方法,在pH8.2时测量,结果有很大误差,是不可取的。
图2原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比(pH7.4vspH8.2)
参考文献:
[1]XicanLi.ImprovedPyrogallolAutoxidationMethod:
AReliableandCheapSuperoxide-scavengingAssaySuitableforAllAntioxidants.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2012,60:
6418-6424.
致谢:
本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1],整理而成。
2