免疫检测技术与知识Word文档格式.docx

免疫检测技术与知识Word文档格式.docx

《免疫检测技术与知识Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫检测技术与知识Word文档格式.docx（21页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

抗原和抗体的结合虽然是互补性的特异性结合，但并不形成牢固的共价键，只是通过非共价键结合。

抗原与抗体这种弱的结合力涉及下列几种分子间的作用力。

　1.静电引力（electrostaticforces）是抗原和抗体分子所带有的相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力，又称库伦引力（coulombicforces）。

例如，抗体分子上带电荷的游离氨基和游离羧基可与抗原分子上带相反电荷的对应基团相互吸引。

这种引力的大小与两个相互作用基团间距离的平方成反比，平均键能约20.9kJ/mol。

　2.范德华引力（VanderWaalsforces）抗原和抗体相互接近时，由于分子的极化作用而出现的引力。

结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比，与它们之间距离的7次方成反比，键能约为4.2～12.5kJ/mol。

这种引力的能量小于静电引力。

　3.氢键结合力（hydregenbondforces）供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。

在抗原抗体反应中，羧基、氨基和羟基是主要供氢体，而羧基氧、羧基碳和肽键氧等原子是主要受氢体，因此氢键结合力较范德华力强，并且更具有特异性。

能的大小取决于氢键的方向，氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6次方成反比，键能约20.9kJ/mol。

　4.疏水作用力两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力。

当抗原抗体反应时，抗原决定簇与抗体上的结合点靠近，互相间正、负极性消失，由静电引力形成的亲水层立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体的相互吸引而结合。

疏水作用力在抗原抗体反应中的结合是很重要的，提供的作用力最大，约占总结合力的50％。

　　综上所述，几种作用力的大小都与抗原抗体分子之间的距离密切相关，只有两分子表面广泛密切接触时，才能产生足够的力使其结合。

抗原与对应抗体之间高度的空间互补结构恰好为这些结合力的发挥提供了条件。

2．抗原抗体亲和性

亲和性（affinity）是抗体分子上一个抗原结合部位与对应的抗原决定簇之间的相适性而存在着的引力，是抗原与抗体之间固有的结合力。

　　亲和力（avidity）是指反应系统中复杂抗原与相应抗体之间的结合能力。

亲和力与亲和性有关，也与抗体的结合价和抗原的有效决定簇数目相关。

　　例如，IgG为两价，其亲和力为单价的103倍；

而IgM为5价，其亲和力为单价的107倍。

亲和力越大，抗原抗体结合越牢固。

　　抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡时其亲和常数用k表示。

K代表亲和力。

K值大的抗体与抗原结合牢固，不易解离，说明该抗体有高亲和力。

3．亲水胶体转化为疏水胶体

抗体和大多数抗原都属蛋白质。

在通常的抗原抗体反应条件下均带有负电荷，使极

化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝集出现沉淀。

当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄；

而且由于抗原抗体复合物形成后，

与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。

此时在电解质的作用下，使各疏

水胶体之间进一步靠拢、沉淀，形成可见的抗原抗体复合物。

二、抗原抗体反应的特点和影响因素

1．特异性特异性（specificity）是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合发生反应的专一性能。

特异性是抗原抗体反应的最重要特征之一。

抗体分子可变区形成大小约为3nm×

1.5nm×

0.7nm的槽沟，其中超变区氨基酸残基的变异性使槽沟形状千变万化，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，因此，抗原抗体结合反应具有高度特异性。

例如：

抗白喉抗毒素只能与白喉棒状杆菌外毒素结合，而不能与破伤风梭菌外毒素结合，反之亦然。

这种高度的反应特异性是一切抗原抗体反应的主体，所以在传染病的诊断、防治等医学和生物学领域都已得到了广泛的应用。

大多数天然抗原物质的构成十分复杂，常含有多种抗原决定簇。

如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗血清出现交叉反应（crossreaction）。

例如，变形杆菌与立克次体之间有共同的抗原决定簇，故斑疹伤寒病人血清可凝集OX19变形杆菌。

　　2．比例性比例性（proportionality）是指抗原与抗体发生可见反应需要一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时，才形成较大的抗原抗体结合物。

以沉淀反应为例，在加入固定量抗体的一排试管中，再依次加入一定量的递增浓度的抗原进行反应，结果发现随着抗原浓度的增加，沉淀很快出现，但抗原超过一定范围之后，沉淀速度和沉淀量随抗原浓度增加反而降低，甚至到最后不出现沉淀，

　　沉淀反应的速度反映了参加反应的抗原和抗体浓度的适合程度，适合程度高反应快，反之则慢。

通常把最迅速出现可见反应时的抗原抗体的浓度比或量比称为抗原抗体反应的最适比（optimalratio）或称等价点（equivalencepoint）。

抗原与抗体比例最合适的范围称等价带（equivalencezone）。

在最适比反应条件下，抗原抗体几乎全部结合成复合物，上清液中基本无游离的抗原和抗体。

当抗原和抗体浓度比超过此范围时，可见反应的速度和复合物的量都会迅速降低，甚至不可见，上清液中可测出游离的抗原或抗体。

因抗原抗体比例不合适而不出现可见反应，称带现象（zonephenomenon）。

如果抗体过量时，称为前带（prozone）；

抗原过量时，称为后带（postzone）。

在同一抗原抗体反应系统中，不管抗原和抗体浓度如何变化，其沉淀反应的最适比始终恒定不变，

　　Marrack提出的网格学说解释了抗原抗体反应比例性的机制。

天然抗原大多是多价的，抗体至少为两价，当抗原与抗体在等价带结合时，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物。

当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价得不到饱和，只能形成较小复合物，并存在有较多游离的抗原或抗体，不能出现可见反应。

但是，当抗原或抗体为单价，不管抗原与抗体的量比关系是否合适，均不能出现可见反应现象。

　　3．可逆性可逆性（reversibility）是指抗原与抗体结合成复合物后，在一定条件下，可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。

由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，在低pH、高浓度盐等条件下，使抗原抗体分子间的静电引力消失而导致解离。

常用于解离抗原抗体复合物的物质有3mol/L硫氰化钾，7mol/L尿素，pH2.4、0.1mol/L甘氨酸等。

解离后的抗原或抗体分子，仍保持原来的理化特性及生物学活性。

例如，外毒素与相应抗毒素结合，毒性被中和，但经稀释或冻融可使两者解离，外毒素恢复其毒性。

三、沉淀反应

沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生结合而出现沉淀的现象。

早在1897年Kraus发现鼠疫杆菌的培养液能与相应抗血清产生沉淀反应。

1905年Bechhold用凝胶基质作免疫沉淀反应。

1946年Oudin首次报告了试管免疫扩散技术，1965年Mancini建立单相免疫扩散法，使定性免疫检验向定量化发展。

此后经过不断发展，建立了多种免疫浊度法，使沉淀试验更为微量精确，快速和自动化，现已成为目前检测抗原、抗体的常用基本技术。

　　根据沉淀反应介质和检测方法不同，将其分为液相沉淀试验，凝胶扩散试验和凝胶免疫电泳试验等三大基本类型。

但这些试验结果通过染色凭肉眼观察结果以致灵敏度较低。

根据沉淀反应中抗原抗体结合使反应系统透光度发生改变，据此建立了以测定透光度为特征的多种免疫浊度法。

现代免疫技术（各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术。

1．液相内沉淀试验

指以含盐缓冲液为反应介质的抗原抗体特异性结合的沉淀试验。

根据实验方法不同所形成的免疫复合物呈现的沉淀现象不一。

将液相内沉淀分为3类

　　①絮状沉淀（flocculation）；

　　②环状沉淀（ringprecipitation）；

　　③免疫浊度试验（immunoturbidimetry）。

　　1．絮状沉淀试验絮状沉淀试验是一项经典实验技术。

梅毒抗体的Kahn试验曾作为絮状沉淀的代表试验。

如今已被更简便敏感的USR或RPR方法替代。

该方法抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。

　　2．环状沉淀试验该方法是Ascoli于1902年建立的，该试验是经典的血清学定性试验之一。

主要用于鉴定微量抗原如鉴定血迹，诊断炭疽。

原理是将抗原溶液叠加在细小玻管中抗体溶液上面，因抗血清蛋白浓度高，比重大，在两液交界的清晰界面上形成白色沉淀环为阳性反应。

　　3.免疫浊度试验经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法学上存在费时、繁琐、敏感度低（10-100mg/L）、难以自动化等缺陷，70年代出现了微量免疫沉淀测定法，即透射比浊法（transmissionturbidimetry）、散射比浊法（nephelometry）和免疫胶乳比浊法（immunolatexturbidimetry），借助多种自动化分析仪器来完成临床体液蛋白的检测。

　　1）透射比浊法可溶性抗原与抗体，在一定缓冲液中形成的复合物，经一定时间后聚合出现浊度，导致入射光在透过反应液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，其光量减少的程度与复合物的含量成正比，可用吸光度表示。

当抗体量固定时，与待测抗原量成正比。

用比浊仪测定，已知浓度的标准参考品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。

　　受检标本的稀释倍数影响检测结果，稀释倍数主要依据吸光度的敏感范围而定。

须注意的是，稀释倍数太低时，抗原过剩，抗血清量不足，不能形成足够的浊度，甚至复合物分解等导致结果假性偏低。

标本应清晰、避免混浊、脂蛋白的小颗粒可使测定值假性升高。

比浊法在特定蛋白分析仪上自动分析也可在全自动生化分析仪上设置参数自动分析。

　　2）散射比浊法

免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可分为两种，即透射比浊仪测定和散射比浊仪测定，两者比较见图10-1。

散射比浊法，又可分为终点射散比浊法（endpointnephelometry）和速率散射比浊法（ratenephelometry）。

终点散射比浊法实质上是透射比浊法的一种改良,原理是在抗原抗体反应基础上达到平衡时测定复合物的量。

　　速率散射比浊法所谓速率是指抗原抗体结合反应在每一单位时间内的速度，连续测定各单位时间的反应速度即为动态观察。

速率法是测定最大反应速率（表10-2），在25s时速率达到90。

以后复合物产生的速率又逐渐下降。

其峰值（peakrate90）的高低与抗原的含量成正比，因此只要捕捉峰值，经数据处理即可得到抗原的浓度，峰值的出现通常在10~45秒，因此检测速度明显加快。

　　3）免疫胶乳浊度法在上述比浊法中，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，为解决快