绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数Word格式.docx

绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数Word格式.docx

《绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数Word格式.docx（17页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

b—液槽厚度，单位：

cm

c—摩尔浓度，单位：

mol/l

摩尔吸光系数可按下式计算：

2．导数分光光度法：

利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。

利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。

通常可以获得1-4阶导数光谱。

在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：

。

其中s为导数的阶数。

因此，可以利用导数光谱进行定量测定。

导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。

由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。

三.实验仪器和试剂

1.Agilent8453UV-Vis分光光度计;

2.移液枪（德国BRAND公司生产）;

3.50ml容量瓶2支;

废液池（烧杯）一只；

4.氨基酸储备液：

色氨酸0.400g/l，苯丙氨酸2.00g/l;

5.去离子水

四.实验步骤

1.吸收光谱的测定

（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为40mg/l,苯丙氨酸800mg/l；

（2）分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm—400nm间测定他们的吸收光谱。

2.导数光谱：

应用软件中的Math下的Derivate功能，设置参数，分别计算出两种氨基酸标准溶液的1阶导数光谱图。

五.数据处理

1.以λ为横坐标，A为纵坐标作出吸收光谱

2.根据ε=，先在吸收光谱上找出峰值波长及相应的吸光度，然后计算试液的摩尔浓度，注意浓度换算。

3.一阶导数光谱的绘制：

对于测量到的一组波长等间隔的吸光度值，可用窗口移动多项式最小二乘拟合求导法获得对应波长的导数值：

（1）

式中j为数据序列中的次序（第j个点）；

C为卷积系数，为一矢量；

N为归一化因子；

2m+1为窗口宽度；

△x为变量的间隔（这里为波长），其上标s为导数的阶数。

计算一阶导数时（s=1），常用二次多项式进行拟合。

则卷积系数C中第i个元素为：

Ci＝i，（i＝-m,-m+1,…,m-1,m）。

而归一化系数为。

例如取m=3（窗口宽度为7）时，C＝（-3，-2，-1，0，1，2，3），N=28。

这样的参数代入式

（1）计算所得，即为一阶导数光谱。

要求对测得光谱计算一阶导数光谱，并作图。

图1.色氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱图

如图1，色氨酸在276nm处有最大吸收峰，A=1.23;

苯丙氨酸在258nm处有最大吸收峰,A＝0.72。

图2.色氨酸和苯丙氨酸的一阶导数光谱图

六.讨论与思考

1．比较导数光谱和吸光度光谱的区别，说明导数光谱的作用。

2．一阶导数光谱的峰值，对应于原光谱的什么位置？

原光谱的峰值所得的一阶导数值为多少？

3．为什么色氨酸的最大吸收波长比丙氨酸大，且摩尔吸光系数也大得多？

补充实验：

测定苯蒸气的紫外吸收光谱

一．实验步骤：

1．取一干燥的1cm石英比色皿，以空气作参比，在波长范围为190nm——300nm间扫空白。

2．加一滴苯在上述比色皿中，快速盖上盖子，待1～2min后再测定它的吸收光谱。

二．讨论与思考：

1．请查阅文献，并指出文献上所提到的苯的吸收峰的波长。

2.为什么苯在这个波长处有吸收峰的出现，即发生了什么跃迁？

3.为什么用紫外分光光度计无法测得苯的精细结构？

实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量

一.实验目的

学习荧光分析法的基本原理和LS－55B发光分析仪的操作。

荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。

利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。

在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；

反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。

在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。

荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。

酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Try）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。

它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。

同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。

1.LS-55型发光谱仪;

色氨酸4mg/l，苯丙氨酸100mg/l;

5.去离子水;

1．打开电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。

设定仪器参数：

全波长预扫描参数，用储备液在50ml容量瓶中配置溶液，加水定溶后，使得色氨酸浓度为0.1mg/l,苯丙氨酸10mg/l；

对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。

同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。

2．从预扫描得到激发和发射波长的初步结果（200–600nm），分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。

激发光谱参数：

扫描波长范围200-350nm。

（Phe）=287nm，扫描速度=1000nm/min,Ex-Slit=10nm,Em-slit=5nm,记录信息；

（Try）=357nm,扫描速度=1000nm/min,Ex-Slit=10nm,Em-slit=7.5nm,记录信息。

发射光谱参数：

扫描波长范围200-400nm；

λex（Phe）=206nm,扫描速度=1000nm/min,Ex-Slit=10nm,Em-slit=5nm,记录信息；

λex（Try）=217nm,扫描速度=1000nm/min,Ex-Slit=10nm,Em-slit=7.5nm,记录信息记住取文件名。

同步荧光光谱：

扫描波长范围200-350nm,Δλ（-）（Phe）=81nm,扫描速度=1000nm/min,Ex-Slit=10nm,Em-slit=15nm,记录信息；

Δλ（-）（Try）=140nm,扫描速度=1000nm/min,Ex-Slit=10nm,Em-slit=12.5nm。

（注意：

由于物质的荧光性质受许多条件的影响，以上实验参数仅供参考，具体参数的选择视实际情况而定。

）

五．数据处理

1．用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。

2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。

在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。

图3.苯丙氨酸荧光谱图

苯丙氨酸扫描激发波长在206nm和260nm两处出现最高峰，本实验选择206nm为最大激发波长。

此外，激发波长曲线在280－300nm处出现了一个十分完美的峰，请注意，此峰为倍频峰，非激发波长峰（由于发射波长固定为287nm，因此激发波长曲线实际在200－286nm之间。

图4.色氨酸的荧光光谱图

色氨酸扫描激发波长在217nm和277nm处有两个最大峰，本实验选择217nm固定为最大激发波长。

六．讨论与思考

1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？

2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？

该波长是否适合于进行定量分析？

3．同步荧光技术有哪些优点？

比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。

4．通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。

苯丙氨酸色氨酸

5．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。

注意事项：

1．实验报告以电子版的形式在交作业专区跟帖子上传。

也可书面提交。

2．实验结束后实验数据放置在网上ftp:

//192.168.17.5可自己下载。

实验三红外吸收光谱的测定

通过红外吸收光谱的测定，掌握NicoletFT-IR的使用方法。

1．本实验用NicoletFT-IR测定有机物以及高分子的红外吸收光谱。

2．红外光谱作为“分子的指纹”广泛用于分子结构和物质化学组成的研究。

根据分子对红外光吸收后得到谱带频率的位置、强度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空间构型，求出化学键的力常数、键长和键角。

从光谱分析的角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确定分子的化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析。

对苯二酚的红外吸收谱图1如上，可以看到在3500cm-1处有个大的吸收峰，这是羟基的吸收峰，3000cm-1左右是C-H的吸收峰，1500cm-1是C=C的吸收峰。

图1对苯二酚的红外吸收光谱

1.NicoletFT-IR傅立叶红外光谱仪（美国热点公司）;

2.压片机（美国热点公司）;

3.多功能反射头（美国热点公司）

4.对苯二酚

5.聚苯乙烯薄膜；

6.自备样品（塑料）;

7.KBr固体

四.实验内容

1.

图1－6CO2分子的反对称伸缩振动（分辨率＝1和4cm-1）

2260

2280

2300

2320

2340

2360

2380

Wavenumbers（cm-1）

SingleBeam

R枝

P枝

空气中CO2的测定

（1）实验步骤：

不放样品的情况下测试空气中的红外吸收谱图，在不扣除背景的情况下在nm下可以看到CO2的红外吸收谱图，在分辨率为4cm-1和1cm-1两种情况下分别测试。

（2）分析两种分辨率下的谱图的异同。

观察CO2的红外吸收精细结构。

2.邻苯二酚的测定

（1）压片：

将少量邻苯二酚固体加入到KBr粉末中，碾碎并拌匀，用压片机压成薄片。

（2）测试：

将压好的样品薄片放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。

（3）谱图解析：

将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度；

分析谱图，将各种官能团指出来。

3.聚苯乙烯薄膜的测定

（1）测试：

将聚苯乙烯薄膜放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。

4.自备样品（塑料）的测定

（1）红外吸收谱图的测定：

测试：

将自备塑料样品放置在红外光谱仪中，测定样品的红