DNA的降解Word文件下载.docx

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（3）在修饰碱基位置化学法断开DNA链；

（4）凝胶电泳将DNA链按长短分开；

（5）根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列

化学降解较之链终止法具有明显优点：

所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。

与包括合成反应的链终止技术不同，Maxam-Gilbert法要对原DNA进行化学降解。

这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。

在这一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一个末端标记的DNA片段在5组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。

因此生成5组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。

每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。

此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。

相对而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以来，基本没有变化。

虽然设计了另一些化学降解反应，但这些反应一般只作为Maxam和Gilbert（1977，1980）最早提出的反应的补充。

这一方法的成败，完全取决于上述这些佞两步进行的降解反应的特异性。

第一步先对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰，而第二步修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5'

和3'

的磷酸二酯链断裂。

在每种情况下，这些反应都要在精心控制的条件下进行，以确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。

随后用哌啶裂解修饰碱基的5'

位置，得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。

比较G、A＋G、C＋T、C和A>

C各个泳道，从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列。

由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。

在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法刚刚问世时，利用化学降解进行测序不但重现性更高，而且也容易为普通研究人员所掌握。

Sanger法南非要单链模板和特异寡核苷酸的，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的简单化学试剂。

但随着M13噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。

然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：

因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。

三、测序策略

确证性测序

从头测序

开始测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以现有有设施来制定测序总策略。

只有一小部分的研究划需需分从头测定大段从测定过和序列，而列多的情况是通过测序对突变（如点突变和缺失）进行定位和鉴定，并证实构建的重组DNA的方向与结构。

用于上述两种目的的方略大不相同。

（一）确证性测序

确证性测序（例如对利用寡核苷酸倡导的诱变而产生的突变体进行测序）往往只需要仅仅一套反应，以取得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序，即可如原以偿。

在许多情况下，等测区落于通用引物的测序范围之内；

若不然，最好的方法就是合成一段长度为17-19核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。

只要可能，应同时测定野生型基因上同源区的序列和突变的相应序列。

直接在同一张放射自显影片上对照有关序列，极有助于确证变异区序列并将使突变体与野生型基因之间任何出乎意料之外的其他差异一目了然。

（二）从头测序

从头测序的目的是要提供一段DNA的准确核苷酸序列，这一区段可长达数千碱基，而其序列从来未经测定。

由于单套测序反应所能准确测定的靶DNA序列最长可达400碱基左右，因引进行从头侧序必须经过精心策划。

长约400碱基的枝DNA可以按互为相反的方向分别克隆于2种M13噬菌体载体（如M13mp18和13mp119）上。

然后每条链的全序列可以通过利用通用测序引物进行的单套反应得以测定。

如果要对更长的靶DNA（如长达数千碱基）进行测序，则可在两种通用策略中一而行：

（1）随机法（或鸟枪测序法）在随机法中，序列资料是从含有靶DNA随机片段的亚克隆中收集而来的。

既不须努力确定这些亚克隆在靶DNA中的位置，也不必设法查明究竟测出的是哪一条链的序列，只要把积累资料贮存起来，最后可用计算机排列妥当（Staden，1986）。

这一方法是由剑桥的医学研究委员会（M．R．C．）实验室率推行的，曾经成功地用于测定人线粒体DNA（Anderson等，1981）、人腺病毒DNA（Gingeras等，1982;

Roberts等，1986）、λ噬菌体DNA（Sanger等，1982），以及Epstenin-Barr病毒DNA（Baer等，1984）的序列。

（2）定向法在定向法中，靶DNA的测序按计划有秩序地进行。

例如，靶DNA的全序列可以通过测定一系列嵌套的缺失突变体的序列而获得，这些突变体具有相同的起点（通常在靶DNA的一端）并分别穿入靶序列区纵深不同距离处，因此它们可以使靶DNA中更遥不可及的区段渐进地落入可利用通用引物进行测序的范围之中。

另一种方法是，利用一套反应中取得的核苷酸序列设计新的寡核苷酸充当后续一套反应的引物，从而循序渐进地获得从示测定过的靶DNA片段的序列。

因此在这一方法中。

DNA序列的积累是通过沿DNA链渐进移动引物结合位点而实现的。

尽管对随机法与定向法的取舍通常由实验室的物力与专长所决定，但仍有一少其他因素也会影响最终的抉择，这些将在稍后加以讨论。

选择随机定向测定策略的影响因素

（1）计算设备任何大规模的测序计划将在很大程度上依赖计算机程序对原始序列资料进行分类、整理和排列（Staden，1986）。

在权衡随机法的利与弊之时，必须将与适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。

如果这些设备尚无从适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。

如果这些设备尚无从谈起，就必须将采用随机策略的想法束之高阁，转而从前已述及的两种定向方法中择一而行。

（2）靶DNA的性质：

如果靶DNA很可能会有散在的重复序列，那么就应当组建嵌套的缺失体用于测序。

计算机在区分重复序列方面可能束手无策，而寡核苷酸引物则会同多个位点发生退火。

（3）完成测序计划所需时间：

完成一个测序计旬所需工作时间可通过以下指示进行估计：

1）从单套反应中平均可是300-400核苷酸的序列。

2）一个人一天可以轻松自如地操作24-32套反应。

3）因此一个测序工作周，可以测出15kb核苷酸序列，这一周包括：

a.用一天时间制备单链DNA模板。

b.用一天时间测定DNA序列。

c.用一天读出原始DNA序列并加以排列。

d.再用两天生物旱生测序、重新进行电泳，以便澄清模棱两可这处并取得各个克隆之间的重叠区序列。

采用随机法，所要测定的序列通常会比靶DNA所具有的实际长度4－6倍。

在大多数情况下，直至双链90％左右的序列测出以后，才能得到单一的一段邻接不断的序列。

由于进行测序的亚克隆是随机挑选出来的，因此靶DNA某些区段的序列在全段序列未能测出前会被重复测定，至于需要多长时间才能找出最后几个亚克隆并进行测序，从而使序列提以测全，则无法未卜先知。

往往会发现，以上亚克隆在文库中得不到充分反映，因此南非要处用与侧翼序列相应的寡核苷酸探针进行筛选，以分离这些亚克隆。

利用限制酶将大分子靶DNA进一步分为大小适中（4－5kb）而易于处理的片段，可以使上述推理上难题得以缓和，每一个这样的片段都可以用随机法单独进行测序。

定向缺失法有时需要投入大量的时间生成并鉴定一整套嵌套的缺失体。

然而一旦这上步水到渠成，则可以从靶DNA上早以妥善安排的多个区段上互为相反的两端向内部延伸，才能测定DNA双逻的全序列。

另一种办法是用单套缺失突变体来取得靶DNA单链的序，然后利用其信息合成一套寡核苷酸引物，以便用于确证DNA互补链的序列（见后）。

（4）使用寡核苷酸合成仪的方便程度：

如果能够无拘无束地使用寡核苷酸合成仪，则可快速、廉价地合成由用户设计的引物。

假定要花1－2天时间来合成一个寡核苷酸，那么在最快速度下每周可以由靶DNA的一个特定起点开始从头测定600-800个核苷酸的序列。

如果同时使用几个起点开始从头测序；

或者也可以将M13mp18和M13mp19噬菌体载体，利用通用引物同时从两端开始测序；

或者也可以将序列内部的限制酶切片段亚克隆循下列原则：

设计DNA测序物时，应遵循下列原则：

1）应寡核苷酸与靶DNA的正确主靶DNA中确凿疑的序列相互补。

尤其是利用循序渐进的寡核苷酸法来测定从未测过的DNA序列时，这一点更加重要。

尽量让新设计的寡核苷酸互补于已知序列的最远端，这是十分自然的人民代表倾向。

然而在大多数情况下，该序列是从测序凝胶顶部间隔紧密的条带中读取的，而在此处发生阅读错误往往司空见惯。

因此紧好保守一些，让所设计的引物与位于样品泳前沿之后一定距离内的序列机互补，在凝胶的这一区段上读出的序列可信程度较高。

2）引物的碱基组分比便应匀称[40-55％（G＋C）]，而且长度至少应有18个核苷酸。

如果（G＋C）％

在上述阈值之外，应将寡核苷酸长度设计为（18+n/2）个核苷酸，其中对AT丰富区，则n=50-（G＋C）％对GC丰富区，则n=（G＋C）％－50。

3）检查新设计二重对称区，因为可自杂交形在发夹或茎环结构的寡核苷酸是低物。

效引

a.其中不含二重对称区，因为可自杂交形成发夹或茎环结构地寡核苷酸是低效引物。

b.它既不会同载体DNA也不会同序列已经测出的靶DNA区段相互补，如能保证这一点，将大大减少寡核苷酸从模板DNA的不只一个位置上引导DNA合成的可能性。

已商品化的大部分用于DNA分析的计算机程序都能够从序列中检索合成寡核苷酸的互补区。

（5）序列的准确性：

如果认真地进行DNA序列测定，错误率将小于0.1％。

但要达到这样高的准确性，必须完整地测定靶DNA两条链的序列并澄清棱两可及相互矛盾之处。

在这一点上随机测序有其优点，因为在该方法中耐需要骤步对丰余的原始序列资料进行累积，从而使最终所排出的序列的准确性大为改观。

然而靶DNA中可能存在一些区域，无论采用随机法还是定向法都不能准确测定其序列。

解决这些凝难序列往往需要花费意外长的时间，有时还要使用碱基类似物（以消除