完整word版菌种选育与培养.docx

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第三章菌种选育与培养

教学目的：

1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法；3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。

教学方法：

讲授

教学手段：

使用多媒体课件

教学内容：

第一节重要工业微生物的分离及菌种要求

1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。

2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。

3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。

4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。

一、工业生产常用的微生物

1、细菌（bacteria）：

枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等；

2、酵母菌（yeast）：

啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等；

3、霉菌（mould）：

根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等；

4、放线菌（actinomycetes）：

链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等；

5、担子菌（basidiomycetes）：

通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发；

6、藻类（algae）：

用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。

二、微生物工业对菌种的要求

目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。

尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求：

1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高；

2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；

3、抗杂菌和噬菌体的能力强；

4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。

三、重要工业微生物的分离

分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。

1、施加选择压力的分离方法

（1）富集液体培养

富集培养是指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。

方法的要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件。

例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。

（2）固体培养基的使用

该方法常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有该酶的作用底物。

2、随机分离方法

（1）抗生素产生菌的筛选

（2）生长因子产生菌的筛选

生长因子如氨基酸和核苷酸等的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过随后的筛选试验检验出产生菌。

（3）多糖产生菌的筛选

可从菌落的粘稠外观识别这类产生菌。

第二节工业微生物菌种的选育

一、自然选育

定义：

在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。

1、从自然界分离获得菌株

一般包括以下几个步骤：

采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。

2、从自发突变体中获得菌株

自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。

因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。

如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株-诱变育种。

二、诱变选育

定义：

使用诱变剂对菌种进行人工诱变，提高突变频率和扩大变异谱的育种方法。

具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。

1、诱变育种的主要环节：

（1）出发菌株的选择

工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parentstrain）。

一般有三种：

从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；已经诱变过的菌株。

选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体的影响。

不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。

选择对诱变剂敏感且变异幅度广的菌株作为出发菌株，可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。

（2）菌悬液的制备

（3）前培养

（4）诱变

物理诱变剂：

各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等；

化学诱变剂：

甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。

诱变剂

诱变剂的剂量

处理时间

缓冲剂

中止反应方法

亚硝酸（HNO2）

0.01～0.1mol/L

5～10min

pH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液

pH8.6，0.07磷酸二氢钠

硫酸二乙酯（DES）

0.5～1％

10～30min，

孢子18～24h

pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液

硫代硫酸钠或大量稀释

甲基磺酸乙酯（EMS）

0.05～0.5mol/L

10～60min，

孢子3～6h

pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液

硫代硫酸钠或大量稀释

亚硝基胍（NTG）

0.1～1.0mol/mL，

孢子3mg/mL

15～60min，

90～120min

pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液

大量稀释

亚硝基甲基胍（NMU）

0.1～1.0mol/mL

15～90min

pH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液

大量稀释

氮芥

0.1～1.0mol/mL

5～10min

NaHCO3

甘氨酸或大量稀释

乙烯亚胺

1:

1000～1:

10000

30～60min

硫代硫酸钠或大量稀释

羟胺（NH2OH∙HCl）

0.1～0.5％

数小时或生长过程中诱变

大量稀释

氯化锂（LiCl）

0.3～0.5％

加入培养基中，在生长过程中诱变

大量稀释

秋水仙碱（C22H25NO6）

0.01～0.2％

加入培养基中，在生长过程中诱变

大量稀释

（5）突变株的筛选

A、营养缺陷型的筛选方法

一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。

淘汰野生型菌株的方法有：

抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。

营养缺陷型菌株的检出方法有：

逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。

B、突变株的筛选

随机筛选法（摇瓶筛选法；琼脂块筛选法；筛选自动化和筛选工具微型化）和理性化筛选

法（运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。

）。

第三节生产菌种的改良

采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但不能达到定向育种的目的。

随着现代生物技术的发展，杂交育种、原生质体融合、DNA重组可达到改良菌种的目的。

一、常规的杂交育种

定义：

指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株，具有定向育种的性质。

真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。

优点：

杂交后的杂种不仅能克服原有菌种生活力衰退的趋势，而且杂交使得遗传物质重新组合，动摇了菌种的遗传基础，使得菌种对诱变剂更为敏感，因此，杂交育种可以消除某一菌种经长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象；通过杂交可以改变产品质量和产量，甚至形成新的品种。

二、原生质体融合

1、标记菌株的筛选

供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。

采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。

通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。

2、原生质体的制备

在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。

影响原生质体制备的因素：

菌体的预处理（用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强）；菌体的培养时间（一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感）；酶浓度；酶解温度（一般控制在20～40℃）；酶解时间（充足的酶解时间）；渗透压稳定剂（对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。

一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性）。

3、原生质体的融合和再生

融合：

是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。

再生：

原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。

影响原生质体融合的因素：

菌体的前处理；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；融合的温度；融合体系的pH值等。

影响原生质体再生的因素：

菌种自身的再生性能；原生质体制备的条件；再生培养基成分；再生培养条件等。

4、融合子的选择

融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。

在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。

在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。

5、灭活原生质体融合技术在育种中的应用（该方法可以不用遗传标记）

灭活原生质体融合技术是指采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一亲株或双亲株的原生质体，使之失去再生能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。

三、DNA重组技术

体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。

它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。

（一）DNA重组过程

1、基因的分离

2、载体的选择

3、DNA分子的切割与连接

4、重组载体引入宿主细胞

5、重组体的选择和鉴定

6、外源基因的表达

（二）分子育种技术

分子育种是应用基因工程手段进行的。

近年来，工程菌已逐渐开始应用发酵生产中。

如：

链霉菌的抗生素生物合成基因克隆；利用基因工程技术生产新的抗生素；利用基因工程技术生产氨基酸；克隆抗生素生物合成基因的7个克隆策略；检测克隆到标准宿主中的个别基因产物；利用产生菌阻断突变株的互补作用；利用突变克隆技术；连锁的抗生素抗性基因的克隆；用人工合成的寡核苷酸探测基因文库；直接克隆抗生素产生菌DNA大片断到非产生菌中；用一种抗生素的克隆DNA去探测相关抗生素的同源基因。

第四节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏

一、微生物菌种的衰退

菌种的退化是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。

菌种的退化会使微生物个体和群体特征发生变化，其中最重要的使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱。

1、菌种衰退的原因

①菌种连续传代导致自发突变或回复突变是菌种发生退化的直接原因。

由于连续传代使培养物经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是不断变化的，与处于休眠状态的培养物相比，细胞的自发突变率要高的多。

菌株经