通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究Word文档格式.docx
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在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白（GFP）基因后，利用pSSHGCMVGFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备GFP重组AAV。
应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度，并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞，荧光显微镜观看GFP表达。
结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×
1011cfu/mL，浓缩后可达2×
1013cfu/mL，说明成功地构建了重组AAV载体。
插入外源基因GFP后，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，能产生具有感染性的重组AAV。
感染了重组GFPAAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。
结论构建的重组AAV通用载体pSSHGCMV可转染外源基因，这为进一步的基因医治奠定了基础。
关键词：
重组腺伴随病毒；
ConstructionofagengeraladenoassociatedvirusvectorandGFPexpressioninratNIH3T3transducedbytherAAVvector
ABSTRACT:
ObjectiveToconstructauniversaladenoassociatedvirus（AAV）vectorandtodetecttheabilityoftherAAVvectortotransfergeneintothetargetcell.MethodsByusingrecombinanttechnique,thegeneelementsofAAVRepandCapgenesbetweenITRsofpSSV9int-plasmidwerereplacedbyexpressingcassetteinpACCMVpLpAplasmid,arecombinantadenovirusshuttlevector.TheexpressingcassetteincludedaCMVpromoter,amulticloningsites（MCS）andapolyAsignal.ThenewplasmidconstructedwasnamedpSSVHGCMV,whichwasauniversaladenoassociatedvirus（AAV）vector.AfterGFPreportgenewasinsertedintoMCSoftheplasmid,therAAVvectorexpressingGFP,pSSVHGCMVGFPplasmid,havebeenconstructedandthenitintroducedinto293cellbymethodofCa3（PO4）2usingthreeplasmidsofpSSVHGCMVGFP,pGF140andpAAV/Ad.Afterthecellwastransfectedfor72h,therAAVwasharvestdandthetitrationsofrAAVstocksandrAAVconcentratedweredetectedbydotblottestusingdigGFPprobe.TheGFPexpressioninratNIH3T3wasobservedbyfluorescencemicroscopafterthecellwasinfectedfor24,48and72h.ResultsTitrationofrAAVstockproducedusingnewrAAVvectorandprocedurerangedbetween1×
1011and2×
1012totalpracticles/mL,anditwasincreased100timesinrAAVconcentratedthanitdidinrAAVstock.TheNIH3T3infectedrGFPAAVexpressedsignificantlyGFPfluorescence,whichshowedthatrGFPAAVwasinfectiousvirions.ConclusionTherAAVvectorconstructedinthispaper,pSSHGCMVplasmid,cantransferexteriorgeneintothetargetcellusingproceedingofrecombinantAAVanditmaybeusedinresearchofgenetherapy.
KEYWORDS:
recombinateadenoassociatedvirus;
vector;
reportgene;
genetherapy;
NIH3T3
感音神经性耳聋是现今危害人类健康的重大疾病。
依照中国残疾人联合会抽样调查统计数据，中国现有各类残疾人总数约6000万，其入耳力语言残疾者就有2057万，占%；
而世界卫生组织的一项区域性统计显示，在全世界范围内有轻度听力损失近6亿人，中度以上的听力损失亿人，严峻阻碍着人类的健康和生活质量[1]。
随着对内耳疾病分子生物学的深切研究和基因医治技术的不断进展，为感音神经性耳聋的临床医治带来了希望。
但基因医治临床应用的最大障碍之一即是转基因技术中载体系统的选择。
在本实验中，咱们成功构建的重组腺伴随病毒（recombinateadenoassociatedvirus,AAV）通用载体pSSHGCMV，可转导外源基因，为进一步用于感音神经性耳聋的基因医治奠定了基础。
1材料与方式
菌株、质粒、酶及试剂DH5α、pACCMVpLpA、pFG140辅助病毒质粒和细胞株（293细胞）由西安华广生物工程提供；
骨架质粒pSSV9int-和pAAV/Ad由美国匹斯堡大学生物研究室构建，第四军医大学基础部病理研究室张桐博士惠赠；
pGFPN2质粒购于CloningTech公司；
牛血清白蛋白、Klenow酶、T4DNA连接酶、dNTP和限制性内切酶购于华丽公司；
RPMI1640培育基购于GibcoBRL公司；
胰蛋白胨、酵母提取物购于英国Unipath公司；
核酸杂交试剂盒和地高辛标记及检测试剂盒购于德国BoehringerMannhein公司；
琼脂糖购于中国科学院生物物理研究所生化厂；
其他试剂及全数实验设备均由西安华广生物公司提供。
pSSHGCMV及pSSHGCMVGFP载体的构建策略见图1。
AAVGFP重组病毒的包装和病毒浓度滴定重溶3种质粒（pSSHGCMVGFP、pAAVAd及pFG140），酒精沉淀一次，加去离子水，定量DNA为1g/L。
配制DNA磷酸钙共沉淀物12瓶。
2×
HBS60mLpSSHGCMVGFP60μLpAAVAd60μLpFG140120μL双蒸去离子水CaCl2600μL（5%）
配制方式：
按顺序先加入2×
HBS（mol/L：
15Na2HPO4、10KCl、280NaCl、12葡萄糖、50HEPES,。
液体配制完毕放置30min，然后加至80%融合的293细胞的培育瓶中，转染5h后，倒掉磷酸钙培育液，并用3-5mL培育液洗3遍。
加入10mL含10%（体积分数）小牛血清的细胞培育液，置37℃、5%（体积分数）CO2孵箱培育72h后，收成细胞，回收重组病毒颗粒。
斑点杂交法测定重组病毒滴度。
图1pSSHGCMV及pSSHGCMVGFP载体的构建（略）
ThestrategyforconstructionoftherecombinantpSSHGCMVandpSSHGCMVGFP
大鼠NIH3T3细胞培育和重组rAAVCMVGFP感染NIH3T3苏醒NIH3T3细胞，接种培育，3d传代1次至第5代，将密度为106个/mL的细胞悬液别离加入预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，放入5%（体积分数）CO二、37℃培育箱中培育。
待细胞成片后，以10倍感染复数（MOI）的病毒剂量感染细胞，感染后24、4八、72h置荧光显微镜下观看，随机计数5个视野的总细胞数和具有GFP荧光的细胞数。
2结果
pSSHGCMV及pSSHGCMVGFP载体的构建图2显示了构建的pSSHGCMV载体质粒酶切鉴定结果。
说明从pACCMVpLpA质粒回收1206bp的具有CMV启动子、多克隆位点和SV40polyA的表达盒已经插入到骨架质粒的两个ITR之间。
图3说明该载体的多克隆位点中的EcoRⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和HindⅢ酶切点在该载体中均是唯一的，同时证明了表达盒的插入方向。
图2pSSHGCMV载体酶切分析电泳图（略）
IdentificationoftherecombinantvectorpSSHGCMV
A:
plasmid;
B:
EcoRⅠ/pSSHGCMV;
C:
PVUⅡ/pSSHGCMV;
D:
100bpladdermarker;
E:
λDNA/HindⅢmarker
图3pSSHGCMV多克隆位点鉴定（略）
IdentificationoftheMSinpSSHGCMV
EcoRⅠ;
KpnⅠ;
BamHⅠ;
XbaⅠ;
SalⅠ;
F:
HindⅢ;
G:
EcoRⅠ+ClaⅠ;
H:
HindⅢ+ClaⅠ;
I:
J:
100bpladdermarker;
K:
λDNA/HindⅢmarker
应用PCR方式成功地在pGFPN2质粒中扩增取得了两头含有内切酶切位点的GFPDNA片段（图4），说明GFPDNA片段已经成功插入到pSSHGCMV质粒中，组建了能够表达GFP的AAV载体pSSHGCMVGFP（图5）。
AAVGFP重组病毒的包装和病毒浓度滴定经斑点杂交证明浓缩后的AAV滴定为×
1013cfu/mL。
结果说明三质粒磷酸钙共沉淀转染293包装细胞，能够有效包装重组AAV。
感染了重组病毒的NIH3T3中报告基因GFP的表达大鼠NIH3T3细胞感染AAVGFP重组病毒24h后，可见到GFP的表达，这时表达的荧光弱，阳性细胞仅占20%左右；
48h后表达增强，75%左右的细胞均有明显的荧光（图6）；
72h后，荧光阳性细胞可达90%。
利用10倍MOI的重组病毒剂量，在体外培育条件能够使90%细胞感染和表达外源基因。
图4PCR扩增产物GFP（略）
TheamplificationresultsofGFP
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