蔡锡渠宫颈癌筛查技术--HPV122检测_精品文档优质PPT.ppt
《蔡锡渠宫颈癌筛查技术--HPV122检测_精品文档优质PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蔡锡渠宫颈癌筛查技术--HPV122检测_精品文档优质PPT.ppt（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
）的发生相关；
1616、1818、3131、3333、3535、3939、4545、5151、5252、5656、5858、5959、6868等。
HPV分型检测的意义分型检测的意义
（1）预测受检者发病的风险度，确定最佳的治疗时期）预测受检者发病的风险度，确定最佳的治疗时期GaryM.Cliffordetal;
CancerEpidemiolBiomarkersPrev2005;
14（5）:
115764提示：
不同的高危型促进LSIL（低度鳞状上皮内病变）向SCC（鳞状细胞癌）转变的能力有差异。
HPV16，18的致宫颈癌风险性大于其他高危型HPV。
基线筛查细胞学阴性基线筛查细胞学阴性/高危高危HPVHPV阳性的女性阳性的女性1010年内年内CIN3CIN3病变的累积发病率病变的累积发病率vKhanMJ,etal.JNatlCancerInst2005;
97:
10721079.Follow-uptime（months）Otherhigh-riskHPV+HPV18+High-riskHPVHPV16+CumulativeincidencerateofCIN3（%）17.2%（11.522.9）HPV16+13.6%（3.623.7）HPV18+3.0%（1.94.2）其它高危型HPV阳性0.8%（0.61.1）高危型HPV阴性4.51527395163758799119.5111020151050基线时HPV16/18阳性者相比其它12种高危HPV型别阳性者，有更高风险进展为高度宫颈病变HPV16/18HPV16/18阳性的短阳性的短期风险也明显高于其期风险也明显高于其它致癌型它致癌型HPVHPV阳性阳性v对对204204例宫颈癌患者前瞻性研究发现，例宫颈癌患者前瞻性研究发现，HPV18HPV18型感染者是预后不良的重要指标，型感染者是预后不良的重要指标，HPV18HPV18阳性阳性55年存年存活率活率54.1%54.1%，而其他高危型感染的存活率为，而其他高危型感染的存活率为83.8%83.8%。
HPV18HPV18型阳性者复发率型阳性者复发率53.6%53.6%，而，而HPV16HPV16型复发型复发率仅为率仅为15.9%15.9%v5151例宫颈癌手术患者中，例宫颈癌手术患者中，99例发生淋巴转移中有例发生淋巴转移中有66例为例为HPV18HPV18型型v107107例晚期宫颈癌患者放疗治疗组中，例晚期宫颈癌患者放疗治疗组中，HPV18HPV18型阳性者型阳性者55年存活率为年存活率为15.5%15.5%，而，而HPV16HPV16型为型为73.1%73.1%对于群体而言对于群体而言HPV16HPV16型感染危害最大型感染危害最大对于个体而言对于个体而言HPV18HPV18型感染危险度最高型感染危险度最高
（2）16、18亚型持型持续感染的危感染的危险性大于其他性大于其他亚型型v对巴西1611名妇女在4个月间隔2次检测HPV，HPV16，18持续阳性致HSIL风险性大于其他高危型HPV持续阳性。
（NicolasF.Schlecht,et.al.JAMA.2001;
286（24）:
3106-3114.）宫颈癌的必要条件高危型的HPV感染HPV持续感染（3）针对不同型别的感染采取不同的处理方案）针对不同型别的感染采取不同的处理方案v相同细胞及组织学类型相同细胞及组织学类型HPV阳性与阴性要区别对待阳性与阴性要区别对待v不同不同HPV感染型别要区别对待感染型别要区别对待例如：
建议HPV16,18型的患者直接进行阴道镜检查；
而对于其他型别的感染，要结合细胞学诊断，一般不需要采取任何治疗方法，但需要按时随访。
4444岁女性，岁女性，20082008年年1010月月2424日，妇检宫颈光滑，滴虫（日，妇检宫颈光滑，滴虫（+）HPV16HPV16，5252（+），），TCTTCT：
炎细胞中度。
：
未行阴道镜检查未行阴道镜检查，20102010年年1010月月1818日。
阴道镜下宫颈活检病日。
阴道镜下宫颈活检病理理:
鳞状细胞癌（中分化）。
未按规范筛查及随访，导致宫颈癌发生。
广东省妇幼保健院广东省妇幼保健院案例分析二、凯普二、凯普HPV12+2检测试剂盒检测试剂盒荧光荧光PCR原理原理在PCR反应体系中有上下游引物，在荧光PCR体系中也有上下游引物，还加入了一个荧光基团-探针在PCR扩增过程中,特异性引物和探针分别与靶序列结合，由于此时荧光基团与猝灭基团离的很近，猝灭基团对荧光基团的发光起到了抑制作用，因此荧光基团不发光。
Taq酶在引物的引导下复制靶序列；
当遇到结合在两条引物之间的探针时，发挥5端外切酶功能，将探针水解，水解下来的荧光基团受激发发射荧光，每合成一条DNA链发射一次荧光信号。
当靶序列呈指数增长时，发射的荧光信号量相应增长，因此只要标本中含相应型别的HPV病毒就会有荧光信号的积累，从而达到检测HPVDNA的目的。
荧光猝灭HPV系列系列产品品v1313种高危型种高危型HPVHPV检测试剂盒检测试剂盒（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）不分型不分型v1414种高危型种高危型HPVHPV检测试剂盒检测试剂盒（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）对对HPV16、18分型分型14141414种高危型人乳头状瘤病毒联合种高危型人乳头状瘤病毒联合种高危型人乳头状瘤病毒联合种高危型人乳头状瘤病毒联合16/1816/1816/1816/18基因分型检测（基因分型检测（基因分型检测（基因分型检测（12+212+212+212+2）试剂盒）试剂盒）试剂盒）试剂盒产品特点产品特点至少需要四通道以上的荧光PCR检测仪器，一次检测出14种高危HPV型别：
HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59,HPV-66和HPV-68，同时能对HPV16和HPV18进行分型检测。
具有-globin基因内对照，可以监测所检测样本的可靠性。
在全封闭体系中完成扩增与检测，有效控制污染操作简便，自动化操作，完成整个过程只需要2-3个小时。
检测区域设计在HPV基因组EE区区，避免造成漏诊。
70%-80%的宫颈癌都的宫颈癌都是由是由HPV16、18型感染引型感染引发的发的，可见在HPV荧光分型的产品中，对HPV16、18分型的重要性SFDASFDA与欧盟的CECE认证资质资质DNA提取提取取取800ul800ul样本离心得沉淀样本离心得沉淀加入细胞裂解液加入细胞裂解液50ul50ul，煮沸，煮沸10min10min1200012000离心离心10min10min即可上机即可上机若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀；
若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次；
血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；
粘液多样本，取样时尽量去除粘液。
应注意防止爆盖：
金属浴可压重物（冰盒、冰袋等）水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点优点：
简单、快捷、方便。
缺点缺点：
HPVDNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。
抑制剂。
v针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本）（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致PCR试剂配制试剂配制HPV12+2PCRMIX（l）Taq酶（酶（l）DNA模板（模板（l）1人份量17.50.52/人份10人份量17552/人份v按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装仪器检测通道选择仪器检测通道选择HPV12+2报告荧光报告荧光淬灭荧光淬灭荧光12种高危型FAMNoneHPV16HEX/JOENoneHPV18ROX/Red610None-globinCy5None我们一般把荧光我们一般把荧光PCR的前的前15个循环信号作为荧光本底信号个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。
扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。
检查检查调整调整基线基线荧光阈值的缺省设置是荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（仪器自动设置，倍（仪器自动设置，auto）。
但我们通常采用手动设置）。
但我们通常采用手动设置（manual），手动设置的原则是该阈值要大于样本的荧光背景值），手动设置的原则是该阈值要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号出现在荧光信号超过阈值后。
段，真正的信号出现在荧光信号超过阈值后。
检查检查调整调整阈值阈值结果分析11定性结果判读定性结果判读11）阴性对照）阴性对照CtCt值均应显示为值均应显示为UndetUndet。
阳性对照阳性对照Ct值值36。
符合以上两个条件，此反应是为有效。
2）样品的）样品的Ct值显示为值显示为Undet，判断为阴性。
，判断为阴性。
3）样品的）样品的Ct值值40，判断为阳性；
，判断为阳性；
4）若为）若为40Ct值值45的样本建议重做，重做结果的样本建议重做，重做结果Ct值值40者为阳性，否则为阴性。
者为阳性，否则为阴性。
5）如果出现）如果出现Ct值值15的强阳性样本，可直接报告为阳性或的强阳性样本，可直接报告为阳性或自动分析，并将其从样品表中剔除，再按上面步骤分析其他自动分析，并将其从样品表中剔除，再按上面步骤分析其他样本，或建议进行样本，或建议进行1/100稀释重做。
稀释重做。
定性报告单上，定量结果栏及参考定性报告单上，定量结果栏及参考范围设置为范围设置为N/A（无效栏）（无效栏）结果分析1扩增曲线出现交叉扩增曲线出现交叉扩增曲线出现交叉，主要是因扩增曲线出现交叉，主要是因为多引物、多探针反应体系中，每为多引物、多探针反应体系中，每种型别的扩增效率不一样所致。
同种型别的扩增效率不一样所致。
同时，样本本身的原因也可能造成荧时，样本本身的原因也可能造成荧光曲线的差异。
光曲线的差异。
常见问题及解决方案2单个临床样本扩增曲线底部上坡式单个临床样本扩增曲线底部上坡式不断抬高不断抬高加入的样本加入的样本DNA含有很多杂质。
含有很多杂质。
重做，重做，加加样前，前，样本本DNA13000rpm离心离心10分分钟，移液，移液时取上清，移液器取上清，移液器枪头浸入液面浸入液面2mm处。
3个别荧光曲线突然个别荧光曲线突然（较大较大）下降下降反应管内留有气泡，由于温度升高反应管内留有气泡，由于温度升高后可能会造成气泡破裂，使荧光值突变后可能会造成气泡破裂，使荧光值突变降低降低，加入模板加入模板DNA后混匀离心，把后混匀离心，把反应管放置仪器内时要检查管内是否有反应管放置仪器内时要检查管内是否有气泡。
气泡。
4阴性对照产生较高荧光阴性对照产生较高荧光反应反应MIX被污染；
反应管不干净，有被污染；
反应管不干净，有杂物
升级会员 