线粒体途径在脱氧胆酸诱导食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用Word文档格式.docx

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吴建涛，徐天娇，龚均，王进海，董蕾【摘要】目的观察线粒体途径在脱氧胆酸（deoxycholate,DCA）诱导体外培养的人正常食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用。

方法采用无血清的角朊细胞培养基体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，采用流式细胞仪检测Rh123和/PI的荧光强度，分析线粒体跨膜电位（ΔΨm）的变化情况;

蛋白免疫印迹法检测细胞色素c（Cyt.c）、Caspase3和多聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）的表达及抑制剂对细胞凋亡和Caspase3活化的影响。

结果食管黏膜上皮细胞用100μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞在对照组为（1.8±

0.6）%，48h为（30.5±

1.7）%;

用200μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞36h可达（43.1±

0.2）%（P0.05）。

PI阴性但Rh123低染细胞开始出现，并逐渐增加，DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下降，表明凋亡细胞在逐渐增多。

Cyt.c和活化的Caspase3的抗体显示，随着线粒体ΔΨm的下降，Cyt.c、Caspase3酶原也被剪切活化，Casapse3的底物PARP也发生了降解活化。

Caspase3特异性抑制剂DEVDFMK部分抑制了DCA诱导食管上皮细胞的凋亡，但对线粒体跨膜电位的下降则没有影响。

结论DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡是通过线粒体途径引起的，线粒体、Caspase3、PARP的活化共同参与了DCA诱导食管黏膜上皮的凋亡过程。

【关键词】脱氧胆酸;

食管黏膜上皮细胞;

线粒体途径;

凋亡　　ABSTRACT:

ObjectiveTostudytheroleofmitochondrialpathwayindeoxycholate（DCA）inducedapoptosisofhumannormalesophagealmucosalepithelialcells.MethodsCulturednormalhumanesophagealmucosalepithelialcellsweretreatedwithdeoxycholate.Weusedflowcytometrytodeterminemitochondrialmembranepotential（ΔΨm）anditspermeability.Expressionsofcaspase3,cytochromecandpoly（ADPribose）polymerase（PARP）weredetectedwithWesternblotting.Caspase3inhibitorDEVDFMKwasusedtoexploretheroleofcaspaseindeoxycholateinducedapoptosisofhumannormalesophagealepithelialcells.ResultsEsophagealepithelialcellstreatedwith100μmol/LofDCA,PInegativebutlowRh123stainedcellsinthecontrolgroup（1.8±

0.6）%,48hwas（30.5±

after200μmol/LofDCAtreatment,PInegativebutlowRh123stainedcellsnumberedup（43.1±

0.2）%at36h（P0.05）.PInegativebutlowRh123stainedcellsbegantoappear,andgraduallyincreased,DCAinducedapoptosiswhenthemitochondrialmembranepotentialdecreased,indicatingthatapoptoticcellsgraduallyincreased.Cyt.candactivationofCaspase3antibodyshowedthatwiththedeclineinΔΨmofmitochondria,cleavageofCyt.c,Caspase3andpoly（ADPribose）polymerase（PARP）ofCasapse3substratealsooccurredinthedegradationactivation.Caspase3specificinhibitorDEVDFMKcouldpartiallyinhibittheDCAinducedapoptosisofcells,butdidnotaffectthedecreaseinmitochondrialmembranepotential.　ConclusionDCAinducestheapoptosisofesophagealmucosalepithelialcellsthroughthemitochondrialpathway.Mitochondria,caspase3andactivationofPARPcleavagearealsoinvolvedintheapoptosis.　　KEYWORDS:

deoxycholate;

esophagealmucosalepithelialcell;

mitochondrialpathway;

apoptosis　　近年来，十二指肠胃食管反流在胃食管反流病的发生发展过程中所起的作用越来越受到国内外学者的重视，尤其是十二指肠反流物中的胆酸在胃食管反流病及其并发症（反流性食管炎、Barretts食管以及食管癌）的发病中所起的作用及其对食道黏膜上皮细胞的损伤作用。

在多种十二指肠反流物质中，胆酸被认为是较严重的损伤物质[1]，并且一些胆酸可诱导细胞凋亡造成食管上皮细胞损伤[24]。

　　线粒体途径是引起细胞凋亡的重要途径之一。

线粒体的功能改变与细胞凋亡密切相关。

许多因素，包括死亡受体介导的信号、促凋亡因子等，引起线粒体功能损伤可使线粒体跨膜电位（mitochondriamembranepotential,ΔΨm）降低和线粒体通透性（mitochondriapermeabilitytransition,MPT）改变，使线粒体膜间隙存在的大量小分子蛋白物质释放出来，并由此引起促凋亡物质释放等一系列变化，包括细胞色素c（cytochromec,Cyt.c）、多聚（ADP核糖）聚合酶[poly（ADPribose）polymerase,PARP]、Omi/HtrA2等细胞凋亡诱导因子，从而诱导半胱天冬肽酶依赖和非依赖性细胞凋亡[56]。

　　本课题的前期研究已经证实，胆酸（盐）能诱导食管黏膜上皮细胞凋亡[79]，但引起凋亡的通路尚不清楚。

因此，本研究将探讨脱氧胆酸（deoxycholate,DCA）在诱导食管黏膜上皮细胞凋亡时线粒体膜通透性和膜电位在细胞凋亡中的作用，确定其是否通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

　　1材料与方法　　1.1主要试剂DCA购自Sigma公司;

碘化丙碇、AnnexinⅤ检测试剂盒购自BDBiosciences公司;

胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;

蛋白酶抑制剂及罗丹明（Rhodamine,Rh123）购自美国Sigma公司，罗丹明用三蒸水配成10μg/mL的储存液，4℃避光保存;

Caspase3、PARP、Cyt.c、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自CellSignalingTechnology,Inc.;

Caspase3特异抑制剂DEVDFMK购自美国Calbiochem公司，使用前溶解于DMSO并分装保存于-20℃;

βactin的抗体购自江苏碧云天生物技术研究所。

　　1.2细胞培养和处理实验过程中，细胞以5×

105细胞/mL的密度接种培养，经DCA按实验设计所需时间和浓度处理后，并在有/无Caspase3抑制剂50μmol/LDEVDFMK预处理的情况下与所需DCA一起进行孵育。

　　1.3流式细胞仪检测线粒体跨膜电位线粒体ΔΨm的检测按试剂盒说明书操作流程进行。

实验分为对照组和实验组。

大约5×

105细胞/mL用100μmol/L、200μmol/L的DCA在不同时间段诱导食管细胞，收集细胞，PBS漂洗;

10μg/mL的碘化丙碇（PI）于37℃中孵育30min，PBS漂洗;

250μg/mL的PI染色。

Rh123和/PI的荧光强度由BeckmanCoulter公司的流式细胞仪检测。

　　1.4蛋白免疫印迹法检测Caspases和PARP的表达细胞用PBS清洗，用上样缓冲液（62.5mmol/LTrisHCl，pH6.8，100mmol/LDTT，69mmol/LSDS，300mmol/L甘油，10mg/L溴酚蓝）裂解。

总蛋白经80～120g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜，用2g/L的丽春红染色以确定蛋白上样量是否相同。

膜经50g/L的脱脂奶粉室温封闭1h后，用Cyt.c、活化的Caspase3（1∶1000）和PARP（1∶500，F2）的抗体4℃孵育过夜，经PBS充分漂洗后用HRP标记的二抗杂交。

βactin抗体杂交，作为上样量的内参。

　　1.5统计学分析采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。

结果以均数士标准差（±

s）表示，组间比较采用χ2检验和t检验，P0.05为差异有统计学意义。

　　2结果　　2.1DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下降为了阐明DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡的机制，我们首先通过PI和Rh123双染检测该胆盐对于线粒体ΔΨm的作用。

Rh123是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体ΔΨm成正比。

正常的活细胞因为线粒体ΔΨm高，所以其摄入的Rh123也高，因此细胞会发出绿色荧光;

而细胞发生凋亡时线粒体ΔΨm会降低，从而会减低对Rh123的吸收，细胞表现为Rh123低染。

未处理的活细胞可被Rh123染色，而未被PI染色。

当食管黏膜上皮细胞用100μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞在对照组为（1.8±

0.6）%，36h为（8.1±

0.2）%，48h为（30.5±

1.7）%（图1A），食管黏膜上皮细胞用200μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞36h可达（43.1±

0.2）%（P0.05）（图1B）。

PI阴性但Rh123低染细胞的开始出现，并逐渐增加，DCA诱导的细胞凋亡时线粒体跨膜电位的下降，表明凋亡细胞在逐渐增多。

　　2.2DCA诱导细胞凋亡时Cyt.c、Caspase3和PARP的活化　　Cyt.c和活化的Caspase3的抗体显示，随着线粒体ΔΨm的下降，可检测到Cyt.c、Caspase3酶原也被剪切活化，产生17kd的活性片段（图2A）。

与此相一致的是，在DCA处理后，Casapse3的底物PARP也发生了降解活化（图2B）。

　　2.3Caspase3抑制剂部分抑制DCA诱导的细胞凋亡用Caspase3特异的抑制剂DEVDFMK来研究Caspase3在DCA诱导食管上皮细胞凋亡中的作