固相微萃取剂色谱综述全解.docx

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固相微萃取剂色谱综述全解

固相萃取及色谱的发展

1.前言

近年来，环境污染事件频发，环境问题已经成为全世界关注的焦点，所以对有毒、有害物质的处理提出了更高的要求[1]。

然而，环境样品基质复杂，干扰物质种类繁多，不利于分析物的测定；而待测分析物的浓度通常较低（μg/L-ng/L），不能直接被分析仪器检测到；复杂基质样品同时存在可能会破坏分析仪器的组分。

因此环境基质样品通常需要经过复杂的前处理过程才能进行分析测定。

样品前处理是指从复杂样品基质中提取、净化、分离、浓缩待测目标分析物的过程，使被测组分转化成可测定的形式以进行定性、定量分析检测。

同时样品前处理过程又是整个分析过程中最耗时、劳动强度要求最高、对分析方法精密度和准确度影响最大的步骤。

传统的样品前处理技术有沉淀分离、索氏萃取液-液萃取等方法，但这些技术萃取效率低、操作步骤复杂、处理时间冗长、且大量使用有毒有机溶剂，污染环境的同时影响操作人员的身体健康。

所以今年来，针对这些问题，研究人员一直寻找新的萃取方法。

目前常用的样品前处理技术主要有固相萃取、液相微萃取等。

本文主要讲述固相萃取及其进展。

2.固相萃取概述

固相萃取是20世纪70年代提出的一种样品前处理技术。

它是一个包括液相和固相的物理萃取过程，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，从而达到分离和富集目标化合物的目的。

大致包括活化、上样、淋洗、洗脱四个步骤：

将装有一定量吸附剂的固相萃取小柱先用合适的溶剂活化，除去吸附剂上的共存杂质，待测样品溶液在外界驱动力的作用下以一定的速度通过吸附剂小柱，目标分析物以及共存杂质被吸附剂所保留，选用适当的溶剂冲洗杂质，最后用少量洗脱剂迅速洗脱待测目标物，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。

如图1所示：

图1

与传统的样品前处理技术相比，固相萃取技术有其独特的优点：

（1）简单的操作步骤和快速的处理过程简化了样品预处理程序。

（2）处理过的样品易于运输，便于实验室间进行质控。

（3）可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂用以处理各种不同性质的有机污染物。

（4）不出现乳化现象，提高了分离效率。

（5）仅用少量的有机溶剂，降低了成本。

（6）易于与其他仪器联用，实现自动化在线检测。

因此固相萃取技术是目前环境分析领域广泛使用的样品前处理技术。

在吸附分离技术的研究中，吸附材料的研究一直是十分活跃的领域，也是吸附分离成败的关键。

在选择吸附材料时应考虑以下一些性能要求：

比表面积要大；颗粒大小均匀；吸附容量大且能定量吸附分析物；吸附空白值低；对水的亲和力应小；吸附选择性要好；重复使用率高。

主要有免疫亲和型吸附剂、分子印迹聚合物、限进介质材料、纳米材料、生物吸附剂五大类。

2.1免疫亲和型吸附剂

生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。

生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。

免疫层析技术就是通过抗原抗体的特异性结合，将待测样品从样品基质中浓缩并分离出来。

免疫亲和柱纯化的方法操作简单，纯化效果显著，是理想的检测复杂样品的前处理方法。

一般情况下就是制备好的抗原或抗体固定化，装载到亲和柱中制得。

其常用的糖类载体如琼脂糖、纤维素等，或人工合成的有机支持物如丙烯酰胺聚合物、共聚物或其衍生物。

其中交联脂糖凝胶是最常用的载体，唯一的缺点就是要用剧毒的溴化氰来进行活化。

免疫亲和层析技术因其高度的专一性、特异性及其方便快捷的特点，越来越受到人们的青睐，在生物及非生物学样品的分析中得到广泛的应用。

其方法主要有以下三种：

⑴免疫亲和层析在直接检测中的应用。

将免疫亲和柱直接连接到相应的检测器上，样品经上样、洗脱后直接进入到检测器检测，这种方法操作方便、快速，是最简单的简单方法；⑵免疫亲和吸附层析先富集纯化待测样品再进行检测。

这种方法就是将上样液先通过亲和柱，收集洗脱液后进行相关处理，再注射入液相、气相等仪器中进行检测，这种方法方便痕量样品的准确检测，可增加待测物的浓度，提高试样的准确度；⑶利用特殊的标记来进行检测。

这种方法适用于待测物质不能直接检测的情况，利用其免疫分析中的抗体标记或待测物的类似标记来达到检测的目的，如酶、荧光标记、脂质体等[2]。

2.2限进介质材料

限进介质作为一种新型的固相萃取吸附剂在一定程度上能克服了大分子残留对固相萃取吸附剂寿命、吸附容量等方面造成的影响，从而提高样品前处理效率。

限进性介质材料最早是在20世纪80年代由Hagestam和Pinkerton发明的，是为了直接注射生物样品而专门设计的一种新型材料。

这种材料具有亲水的外表面，孔内表面修饰的是疏水性的三肽基团。

得到的这种材料对生物大分子具有体积排阻功能的同时，还能实现对小分子分析物的提取和富集。

限进介质的外层表面经过亲水性修饰，内部孔径也能得到适当控制。

根据体积排阻机制，一方面样品基质中的大分子进不到内孔中去，但外表面的亲水层使得被排阻的生物大分子不会发生不可逆的变性和吸附，大分子可通过溶剂经死体积或近于死体积被洗脱除去，即不被保留于外层；另一方面样品基质中的目标物小分子能通过孔径进入到限进介质内部并由疏水作用和静电作用被保留下来。

限进介质的优势在于即使样品中含有生物大分子，也可以对目标物小分子进行有效萃取。

该技术已经在生物体液的分析测定中获得较多的应用,其在环境样品分析中的应用研究也已开展。

例如：

徐倩采用限进介质-高效液相色谱（RAM-HPLC）法测定患者血浆中卡马西平浓度，结果与荧光偏振免疫法测定进行比较。

数据显示RAM-HPLC法效果更好，更适合特殊病例监测及相关研究。

虽然限进介质固相萃取技术能有效排阻样品基质中大分子的干扰，但仍有待改进之处。

例如现有的限进介质固相萃取剂对所有小分子都有保留作用而对目标小分子的萃取选择性还不够高、富集倍数还不够大等。

而分子印迹技术可以解决这方面的问题。

2.3分子印迹聚合物

分子印迹聚合物通过在模板分子周围形成高度交联的刚性分子，除去模板分子后，在交联的结构中留下具有结合能力的作用位点和特异的空间构型，从而仅对模板分子具有高度的识别能力。

分子印迹聚合物的制备过程通常分为以下三步：

（1）在共价键或非共价键作用下，使模板分子与功能单体之间形成某种可逆复合物；

（2）加入交联剂，通过引发剂进行光聚合或热聚合，在可逆复合物周围形成聚合反应，将复合物“冻结”起来，形成刚性聚合物；

（3）用一定的物理或化学方法，将模板分子从聚合物中洗脱出来，在聚合物中便留下与模板分子形状和大小相同、结合位点在空间排列上互补的“三维孔穴”，MIP正是基于这些“三维孔穴”完成对模板分子的特异性识别。

如图2所示：

分子印迹聚合物除了具有稳定性好，耐高温，耐酸碱，耐溶剂性好，重复使用率高等特点外，其最大的优势是具有强大的分子特异性识别性能，能够高选择性地从基质复杂的样品中分离、富集目标分析物，并排除基体干扰，从而提高分析的精密度和准确性，降低方法检出限。

分子印迹聚合物的以上优点使其非常适合于作为固相萃取填料，主要应用于包括环境分析、药物分离及食品痕量检测等方面。

例如，2015年，李秀娟[3]等使用溶液-凝胶法引入C4制备MIP-SPIE纤维用于甲基对硫磷的检测（以甲基对硫磷为目标分子，C4为功能单体），结果良好。

但目前也存在一些挑战，比如印迹容量低和功能单体单一、水相识别等。

所以以后应该积极应对挑战并找到有效的解决策略，深入拓展分子印迹固相吸附剂在色谱样品前处理方面的应用。

图2MIP合成示意图

2.4纳米材料

纳米材料[4]是指在结构上具有纳米尺度特征的材料，当一种材料的结构进入纳米尺度特征范围时，由于其尺寸已经接近光的波长，表现的特性往往不同于该物质在整体状态时所表现的性质，如具有小尺寸效应、表面与界面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等。

其中纳米材料技术着重于纳米功能性材料的生产（超微粉、镀膜、纳米改性材料等）和性能检测技术（化学组成、微结构、表面形态、物、化、电、磁、热及光学等性能基于纳米材料的这些性质，其在固相萃取、生物学、药学等领域有着重要的作用。

在固相萃取方面主要有三类：

磁性纳米材料、碳纳米管、石墨烯。

2.4.1磁性纳米材料

磁性纳米材料具有小的尺寸、大的比表面积、良好的分散性、较强的吸附能力等优点具有顺磁性，在外加磁场的作用下易实现固液分离。

因此磁性纳米材料可作为磁性固相萃取吸附剂应用于样品中痕量组分的分离富集，且经过对磁性纳米颗粒的修饰可实现对特定组分的选择性吸附。

常见的磁性纳米材料主要是铁、钴、镍的金属氧化物及其复合物，Fe3O4作为一种磁纳米微粒，由于其制备方便，对人体无毒副作用，具有较好的生物相容性和生物降解性等特点，是目前研究最广泛的磁纳米材料之一。

磁纳米的制备方法有共沉淀法、水热法、微乳液法、高温热解法和溶胶-凝胶法（Sol-Gel）等。

2.4.2碳纳米管

碳处于金属与典型非金属之间，是一种结构特殊的非金属材料，由碳元素组成的纳米材料统称为纳米碳材料。

碳纳米管（CNTs）是纳米碳材料中的一员。

1991年日本NEC公司的Lijima在氩气直流电弧放电后的阴极碳棒上发现一种由碳原子构成的直径几纳米、长几微米的中空管，并将其命名为碳纳米管，此后它就以其独特的结构和物理化学性质受到人们的广泛关注。

碳纳米管[5]是由单层或多层石墨片一层或若干层碳原子围绕中心轴按一定螺旋角卷曲而成的笼状“纤维”，内部是空的，外部直径只有几到几十纳米，每层由一个碳原子通过sp2杂化而构成的六角形晶面，最短的碳碳键长为0.142nm，长径比约为100-1000。

理想的碳纳米管很轻，但很结实，它的密度是钢的1/6，而强度确是钢的100倍。

根据形成条件不同，碳纳米管可分为单壁碳纳米管（SWNTs）和多壁碳纳米管（MWNTs）。

单壁碳纳米管由单层石墨卷成柱状无缝管而形成，是结构完美的单分子材料；多壁碳纳米管可看作由多个不同直径的单壁碳纳米管同轴套构而成。

CNTs由于其机械强度高、比表面积大、耐酸碱能力强、耐热性好等独特的物理、化学性能，使其具有作为SPE吸附剂的巨大潜力，现有文献表明CNTs对许多有机和无机化合物都有着优良的富集性能。

将磁性材料与CNTs的优势有机整合，通过一定技术手段在CNTs表面沉积Fe3O4、α-Fe2O3、γ-Fe2O3等具有磁性的纳米粒子，合成一种兼具磁性材料的铁磁性和CNTs高富集性能的磁性CNTs复合材料，有望在富集检测中得到广泛的应用。

尽管CNTs在许多领域都有广阔的应用前景，但由于其在溶剂中溶解性差，易聚集成束，分散性差，且CNTs的表面活化能很高，较难被磁性粒子所浸润，大大限制了其的应用。

针对这一系列问题，在CNTs表面包覆磁性纳米颗粒前需对其表面进行预处理。

2.4.3石墨烯

单层石墨烯是一种以sp2杂化连接的单原子层构成的新型二维平面纳米材料，厚度只0.334nm，其基本结构单元为稳定的苯六元环，是目前最理想的二维纳米材料。

并且石墨烯具有离域π电子体系，可以和富电子体系形成强的π-π作用力，这说明此物质对于含苯环的物质具有较强的吸附能力，而且它超高的比表面积也使其吸附负载能力优于其他材料。

与此同时，石墨烯的大离域p电子系统也使其与含碳环结构的化合物有很强的吸引力，而这一结构广泛存在于药物分子、环境污染物和生物分子中。

这使得石墨烯成为了吸附此类目标物的最佳选择，然而石墨烯很难大量直接制备，一般是通过化学法还原氧化石墨烯。

石墨烯可由天然石墨制备，具有成本低廉、原料易得、且容易实现规模化制备的优点，比碳纳米管更具竞争优势，因此石墨烯及其复合材料有望成为用于固相萃取的新型吸附材料。

例如可用作固相微萃取涂层，用作磁固相萃取吸附剂，Huang等将石墨烯固相萃取用到生物大分子的分离，分离萃取了人血浆中的谷胱甘肽，回收率在92-108%，显示了石墨烯对生物样品良好的分离