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专业：

指导老师：

学生：

中国﹒贵州﹒贵阳

2013年6月

中文摘要IV

英文摘要V

前言1

1.BMP蛋白2

1.1BMP结构和功能2

1.2BMP诱导成骨机制2

2.Noggin基因的概况3

2.1Noggin基因的结构3

2.1.1Noggin基因结构特征4

结果25

致谢51

参考文献52

中文摘要

目的：

研究noggin、骨形态发生蛋白2（bonemorphogeneticprotein2，BMP2）、胰岛素样生长因子I（insulinlikegrowthfactorI，IGF-I）对成骨细胞增殖和分化的调节作用。

方法：

1、将人成骨肉瘤细胞MG63于RPMI1640培养基中培养，添加不同浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白进行药物干预，用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl-tetrazolium，MTT）法研究细胞的增殖率。

2、选用最适浓度的noggin、BMP2、IGF-I蛋白作用成骨细胞，运用ELISA方法和RT-PCR技术分别检测成骨细胞分化标志物骨碱性磷酸酶（bonealkalinephosphatase,BALP）和骨钙蛋白（osteocalcin,OC）的蛋白含量和mRNA的表达情况。

结果：

1、各药物干预组OD值与对照组相比有统计学差异（P＜0.05），对成骨细胞增殖的作用效应呈剂量和时间依赖性，其作用的最佳时间均在72h。

各药物组内之间比较，确定了最佳作用浓度，BMP2为2×

10-9mol/L，对MG63细胞的增殖率达179.59℅；

noggin为8×

10-9mol/L，对其增殖的抑制率达到15.51℅；

IGF-I为1×

10-8mol/L，其增殖率达189.80℅。

结论：

BMP2、IGF-I对MG63细胞增殖有促进作用，而noggin则抑制MG63细胞的增殖。

Noggin、BMP2和IGF-I促进BALP的分泌。

Noggin对OC蛋白的分泌有抑制作用，而BMP2、IGF-I则促进OC蛋白的分泌。

关键词：

Noggin蛋白，BMP2蛋白，IGF-I蛋白，成骨细胞，增值，分化

英文摘要

Object:

Theaimsistostudytheeffectsofnoggin,bonemorphogeneticprotein2（BMP2）andinsulin-likegrowthfactorI（IGF-I）ontheproliferationratesanddifferentiationofosteoblasts.

Methods:

ThehumanosteosarcomacelllineMG63werechosenusingtheRPMI1640mediumwith10℅fetalbovineserum（FBS）.Then,theculturedMG63cellswereexposedtoBMP2,nogginandIGF-Iatdifferentconcentrationswithzeroconcentrationascontrolgroup（CON）.AbilityoftheproliferationofMG63cellswasdetectedbymethylthiazolyltetrazoliummethod（MTT）.theconcentrationofBALPandOCofosteoblastsweredeterminedbyELISAmethod.atdifferenttimepoints（12h,24h,48h,72h）afteroptimaldosageofnogginBMP2,IGF-Iwereaddedintotheculturemedium.AndtheexpressionlevelofBALPandOCwereinvestigatedbyreversetranscriptionPCRatthesametime.

Results:

1.TheproliferationabilityofMG63cellstreatedwithBMP2,nogginandIGF-IgroupsweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.05）.TheeffectsofthreefactorsonMG63cellwasdose-dependentlyandtime-dependentlyafterculturedfor72h.ThemosteffectivegrowthofMG63cellsshowedat2×

10-9mol/LofBMP2withtheproliferationrateof179.59℅and1×

10-8mol/LofIGF-1withtherateof189.80℅,while8×

10-9mol/Lnogginwiththeinhibitoryproliferationrateof15.51℅,respectively.

2.TheconcentrationofBALPtreatedwithBMP2,nogginandIGF-IgroupsweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.05）for48h,especially,thenoggingroupwasextremelysignificant（P＜0.01）,andtheBALPmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent（P＜0.05）.

3.TheconcentrationofOCtreatedwithnoggingroupsweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.01）for24h,buttheOCmRNAexpressionwerenotsignificantlydifferent（P＞0.05）.TheconcentrationofOCofBMP2groupweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroupsignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.01）,andtheOCmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent（P＜0.05）.TheconcentrationofOCofIGF-IgroupweresignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroupsignificantlydifferentcomparedwiththatofCONgroup（P＜0.01）,andtheOCmRNAexpressionwerealsosignificantlydifferent（P＜0.05）.

Conclusion:

BMP2andIGF-IpromotedtheproliferationofMG63cellswhereasnoggininhibited.Noggin,BMP2,andIGF-IenhancedtheconcentrationofBALPinosteoblasts.BMP2andIGF-IimprovedtheconcentrationofOCinosteoblasts,whereasnoggininhibited.

Keywords:

Noggin;

bonemorphogeneticprotein2（BMP2）;

insulin-likegrowthfactorI（IGF-I）;

MG63cell;

proliferation;

differentiation.

前言

生长是动物个体发育特有的生理特点，其主要表现在体高体长的增长方面。

而体高体长的增长则源于骨骼的纵向生长，从而形成相应的骨骼系统，达到体高体长的增长的目的。

骨骼系统也是机体非常重要的一个组成部分，它支撑躯体，保护内脏，并且和骨骼肌一起协调配合完成其运动功能。

在骨骼的生长发育过程中，骨组织不断进行着新骨形成和旧骨吸收的骨重建过程，即骨形成（boneformation）与骨吸收（boneresorption）的动态平衡代谢过程。

骨形成由成骨细胞介导来完成。

在骨形成过程中，成骨细胞主要经历细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和细胞凋亡四个阶段。

在幼年生长时期，骨形成远远大于骨吸收（KrupaBetal,2005），为骨骼的生长提供了良好的基础，也为体高体长的增长提供了重要的保证。

在成年时期，骨的形成较为稳定，骨骼的生长不再发生变化，这主要是受到骨形成与骨吸收相对均衡的一个动态调节作用来完成。

在晚年时期，则主要趋向于骨吸收大于骨形成，从而骨形成会受到一定的影响，这将导致一系列骨疾病的发生，比如在老年人群体中常出现的骨质疏松症。

然而骨骼的纵向生长是一种十分复杂的过程，是多种内分泌激素、生长因子在时空上对生长板综合作用的结果。

内分泌系统的全身性激素如生长激素、降钙素、甲状旁腺激素、性激素、糖皮质激素等，与生长因子如胰岛素样生长因子-（Iinsulin-likegrowthfactor-I，IGF-I）、骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticproteins，BMPs）、转化生长因子（transforminggrowthfactorTGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactors，FGF）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、甲状旁腺素相关肽（PTH-relatedpeptide，PTHrP）等局部因子，以及外源性物质如维生素D等相结合，共同调节骨骼生长过程。

1.BMP蛋白（一级标题）

1.1BMP结构和功能（二级标题）

在1965年，Urist首次发现骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP），BMP属于转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β）超家族的一员，具有诱导骨形成的作用，现已发现其家族至少有20多个成员。

BMP是一种低分子量酸性多肽，属于二硫健交联的生长和分化因子（WozneyJM等，1998）。

是结构类似的高度保守的功能蛋白质族，其C-端有一个高度保守的结构域，内含7个位置稳定的半肤氨酸，这对于形成正确的二聚体结构有重要意义。

研究发现，BMP的活性形式为二聚体，它既可以两个相同的链形成的同源二