小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长Word下载.docx
《小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长Word下载.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
采纳MTT法测定，与空载体转染的MIN6细胞株相较，三株Reg3α稳固转染细胞株，7d后细胞数量升高2倍。
结论本研究结果说明已成功地成立了过表达Reg3αcDNA的胰岛MIN6细胞。
Reg3α可能具有内分泌作用，增进胰岛细胞生长。
【关键词】MIN6细胞株；
胰岛；
Reg基因；
转染；
生长
ABSTRACT:
ObjectiveTocreateaMIN6celllineoverexpressingmurineReg3αcDNAandtoinvestigateitscellviabilitycharacterunderlowglucoseconcentrations.MethodsThefulllengthmurineReg3αcDNAwasinsertedintotheplasmid（）.ThenMIN6cellsweretransfectedwiththeReg3αandvectoralonetoestablishReg3αoverexpressionandemptyvectorMIN6cellline.Reg3αproteininthelowglucoseconcentrationcellmediumwasdetectedbyWesternblot.CellviabilitywasevaluatedbyanMTTreductionconversionassay.ResultsThreeReg3αoverexpressionMIN6cellswereconfirmedbyrealtimePCRandWesternblot.Reg3αexpressionwasbarelydetectableinthecellstransfectedwiththeemptyvectoralone.Incontrast,thelevelsofReg3αmRNAandproteininthreepcDNAReg3αtransfectedcloneswereincreasedbyanaverage10and6fold,respectively.WesternblotalsorevealedReg3αproteinreleaseintotheculturemedium.InMTTcellproliferationassay,comparedtovectortransfectionalone,threeclonesofReg3αoverexpressionMIN6cellsexhibited2foldincreasesincellnumberover7dayswhenculturedinthepresenceof10mL/LfetalbovineserumandLglucose.ConclusionTheReg3αoverexpressionMIN6cellshavebeenestablished.Reg3αproteinwasdetectableinculturemedium,supportinganendocrineaction,andReg3αoverexpressionpromotedisletcellgrowth.
KEYWORDS:
pancreaticislet;
Reg3αgene;
transfection;
MIN6cellline
1988年，TERAZONO等[1]发觉对胰腺切除90%的大鼠喂饲多聚（ADP核糖）聚合酶抑制剂—尼克酰胺后能够增进胰岛的新生。
从头生胰岛cDNA文库中分离取得Reg基因（regenerationassociatedgene），可翻译一种刺激胰岛β细胞生长的分泌蛋白，改善切除90%胰腺的糖尿病鼠及非肥胖糖尿病（NOD）鼠的疾病状态。
1997年命名为RegⅠ基因。
咱们依照检索GenBank及查阅Pubmed相关文献，确信已有18个Reg基因家族成员被克隆和鉴定[2]。
依照蛋白质的序列特点，人类和鼠的Reg家族蛋白应属于C型凝集素超家族。
尽管Reg基因家族从碱基与氨基酸序列具有高度同源性，而且都具有单个C型凝集素糖基识别区，但各自又具有不同的结构特点[3]。
已有研究发觉：
RegⅠ和INGAP（isletneogenesisassociatedprotein）能够在体外或体内增进β细胞新生，减少β细胞凋亡[45]。
但是其他新的Reg基因功能尚未说明。
为了进一步明确过度表达的Reg3α在体外对胰岛β细胞生长的阻碍，本实验将Reg3α和空载体别离转染到MIN6细胞中以成立过表达Reg3αcDNA的胰岛MIN6细胞株和空载体细胞株（以下简称MIN6/Reg3α细胞和MIN6/，用于Reg3α基因的功能研究。
1材料与方式
材料MIN6β细胞株由加拿大McGill大学刘均利教授提供。
pBSReg3αcDNA由日本奈良医科大学的SHINTAKASAWA博士提供。
、DMEM培育基、胎牛血清（GIBCO）、AntibioticAntimycotic（100×
）购自Invitrogen公司。
QuantiFastSYBRGreenRTPCR一步法试剂盒及QuantiTectReg3α引物购自加拿大QIAGEN公司，G418自GibcoBRL公司购买。
ECL高级Westernblot检测试剂盒购自Amersham公司，抗小鼠Reg3α单克隆抗体购自R&
amp;
DSystems公司，抗小鼠βActin单克隆抗体购自美国SantaCruz公司，其余化学试剂均购自美国Sigma公司。
方式
DNA载体构建全长Reg3αcDNA（GenBankaccessnumberNM_011259）自质粒载体Bluescript中的EcoRⅠ和KpnⅠ位点中酶切后插入到质粒载体中，该载体含有巨细胞病毒（CMV）调剂区及可选择性标记neo。
EcoRⅠ、KpnⅠ双酶切BluescriptReg3α和载体，经琼脂糖电泳后回收目的条带，通过电泳估量回收后二者的量，然后依照载体∶片段为1∶7混合，利用T4DNA连接酶于16℃留宿，将目标片段与载体连接，最后取25μL连接产物转化100μL感受态DH5α，涂布于100mg/L氨苄青霉素LB琼脂平板上。
于37℃孵育14h后，平板上长出15个克隆，将这些克隆接种至含100mg/L氨苄青霉素的LB培育基，置37℃以260r/min震摇14h后取菌液，选取5个克隆菌液提取质粒，作PCR并以EcoRV和HindⅢ、XhoⅠ和HindⅢ双酶切验证目标片段的存在。
选取一个克隆送McGill大学基因检测中心测序。
测序结果证明Reg3α基因已经插入到载体，未显现点突变和读码框移。
稳固细胞株的培育及转染挑选当培育于T75培育瓶中的MIN6β细胞（18～20代）80%汇合时，用含1g/LETDA的1g/L胰酶消化并吹散，分种12孔板中，每孔×
106个细胞，置于100mL/L胎牛血清、L葡萄糖、10mL/LAntibioticAntimycotic、Lβ巯基乙醇DMEM培育液中37℃、50mL/LCO2培育箱内培育24h。
利用Transfectamine2000转染Reg3α和载体，转染后的MIN6细胞置于含5×
10-4g/LG418培育液内4周，挑出存活细胞（标记为第4代），转移到含2×
10-4g/LG418的T25培育瓶继续培育。
采纳RealtimePCR和Westenblot方式检测第7～8代稳固转染MIN6细胞Reg3α的表达，挑选出过表达Reg3αcDNA的胰岛MIN6细胞株。
Reg3αmRNA的分析用硫氰酸胍方式将总RNA从转染的MIN6细胞中提取。
RNA浓度由ND1000分光光度计（NanoDrop）测定。
以βactinmRNA作为内参照，每一个样品采纳5ng总RNA与Reg3α引物（QT00093534），依照QIAGEN的QuantiFastSYBRGreenRTPCR一步法说明，上Lightcycler实时荧光定量PCR仪（德国罗氏公司），在mRNA水平上检测Reg3α的表达。
蛋白的分析采纳蛋白裂解液（150mmol/LNaCl,10mmol/LTris，pH，1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA,100g/LTritonX100，5mL/LNonidetP40，100mmol/LNaF，10mmol/Lsodiumpyrophosphate，10mmol/Lsodiumorthovanadate，蛋白酶抑制剂RocheAppliedScience）在4℃提取细胞蛋白。
用Brad法蛋白定量，50μg蛋白被130g/L聚丙烯酰胺、1g/LSDS胶分离，再转移到醋酸纤维素膜，转印膜用含50g/L脱脂奶粉的TBST室温封锁1h，然后加入抗Reg3α抗体（用封锁液1∶500稀释）4℃冷室中留宿。
用TBST洗膜3次，每次10min，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（用封锁液1∶5000稀释），室温孵育1h。
用TBST洗膜3次，每次10min。
用增敏化学发光底物试剂检测。
以MIN6/Reg3α及MIN6/细胞的βActin表达作为内参照，别离检测细胞及其培育基的Reg3α的表达。
Reg3α稳固转染细胞增殖测定采纳MTT（molecularprobeinvitrogen）测定。
Reg3α和载体稳固转染的细胞种在96孔板，8000个/孔，待细胞85%贴壁，换成5mg/LBSA无血清培育液细胞同步化培育36h，弃去原有培育基，换用10mL/L的胎牛血清和L的葡萄糖培育液培育，别离在第一、3、五、7、9天MTT测定细胞增殖率。
每组10个复孔，每孔总反映体系为200μL。
别离在上述设定的时刻点，用倒置显微镜观看细胞，然后每孔加入MTT10μL，继续培育4h。
弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min，酶标仪（德国BGM公司，型号：
POLARstarOPTIMA）测定540nm下各个组实验对象的吸光度。
实验重复3次，对结果进行统计学分析。
统计学处置所有实验数据以均数±
标准差表示。
由统计分析软件处置。
采纳单因素方差分析进行组间比较，两组比较采纳成组设计资料t查验，P&
lt;
为不同有统计学意义。
2结果
Reg3α稳固转染MIN6细胞的鉴定和挑选载体及Reg3α转染的MIN6细胞经G418的选择，别离挑出M
升级会员 