分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展Word文档下载推荐.docx

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现将有关研究进展做进一简要综述。

　　传统方法依靠直接或间接含药培养进行结核分支杆菌利福平耐药性鉴定，这是体外结核杆菌耐药性的直接证据，并且可以了解其对利福平耐药程度。

但各实验室间所用培养基不同，检测方法不同，结果判定标准不一，导致结果报告差异，并且由于结核分支杆菌本身属于缓慢生长菌，使得耐药培养耗时长，通常需8～12周，不能满足现代短程化疗需要。

　　近年发展起来的应用BACTEC460TB系统进行结核杆菌快速培养及药敏测定可以大大缩短结果回报时间，但此法建立在培养方法基础上仍需数天出结果，加之仪器试剂昂贵，有放射性污染等，限制了临床广泛应用。

　　1利福平耐药基因的研究

　　关于结核杆菌利福平耐药机制一直存在三种假设，膜通透性改变、耐药质粒介导及染色体组基因突变，其中已证实耐药基因突变与利福平耐药有密切关系。

　　对于细菌利福平耐药基因研究首先在大肠杆菌取得重要突破。

首先发现利福平耐药的大肠杆菌其RNA聚合酶有突变并且只发生在β亚单位上，并推知产生这种β亚单位突变的基因位点相接，进一步对基因研究获得了大肠杆菌野生株编码RNA聚合酶β亚单位基因序列，并发现耐利福平的大肠杆菌有rpoB基因突变。

由于编码RNA聚合酶基因在细菌进化中呈高度序列保守性，根据对大肠杆菌利福平耐药基因的研究资料，Telenti[1]首先对结核分支杆菌利福平耐药基因突变进行了全面研究，发现在与大肠杆菌rpoB基因突变高发区相应位点的长69bp片段内，64/66耐药株有突变发生，而未见于56株利福平敏感结核菌株。

此后许多研究都证实这一结果，并发现发生于此区城内新的突变位点[2～5]。

而Miller做了这样一项研究，他应用致点突变技术造成编码rpoB基因531号氨基酸碱基突变并将其导入利福平敏感的耻垢分支杆菌株LRZZZ中，使之发生了表型改变，即由原来的利福平敏感株转为利福平耐药，也证实rpoB基因突变是导致利福平耐药的唯一原因。

Williams对一患者感染的结核杆菌株发生利福平耐药表型转换前后做了rpoB基因序列分析研究，证实表型发生改变后其耐药基因发生了改变。

但ropB基因突变致利福平耐药详细机制目前还未十分明了。

　　2分子生物学检测方法

　　上述对结核杆菌利福平耐药机制研究取得的重要成果为运用分子生物学方法进行耐药性评估提供了坚实的理论依据，其技术路线基本上是在用PCR方法对rpoB基因突变集中区域扩增基础上，对扩增产物进行突变鉴定，归纳

1直接顺序法对突变高发区城序列分析是鉴定突变的最直观可靠的方法，可以准确判定突变的有无及突变性质，也是其它快速间接鉴别方法的金标准。

应用放射性同位素或荧光标记测序法，已发现许多突变位点及不同的氨基酸置换。

突变在511-533这一区域内发生率达95％以上，其中以531，526，533，516四个位点最为常见[1～5]。

Williams研究了流行病学特征和结核杆菌利福平耐药突变性质之间的内在联系，认为突变位点及性质与耐药模式及程度，IS6110图谱及地位来源等无明显相关关系。

但Taniguechi有不同意见，他研究结果表明513，526，531位点的突变导致对利福平高度耐药而其他位点则明显低度耐药或根本无耐药性。

总之直接测序可以得到突变详细资料，还可以对新发现突变进行鉴定，不足之处是仪器试剂昂贵，操作复杂，成本高，有放射性污染，不适于普遍推广应用。

2多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法其原理为根据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的改变判定单个碱基变异。

由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方法扩增这段基因，直接电泳判定突变有无，大大简化了突变分析操作。

Telenti[1]最先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方法的结核杆菌rpoB突变中的应用价值。

所有利福平耐药菌株均成功地被检测出来，证明此方法特异准确。

它可以同时进行大量临床标本筛选，使结果回报时间缩至48～72小时。

目前国内外本方法的研究较多，并已有成功用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报道[2,7,8]。

SSCP方法为临床快速简便鉴定结核杆菌ropB基因突变开辟了新领域，尽管存在一定不足，如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时差异不易区分、不能鉴别沉默突变等，但仍不失为一种有广泛应用前景的方法。

3双脱氧指纹图法在对PCR产和的进行ropB基因突变检测方法的研究中，Felmee应用了ddF法，这种方法结合运用了双脱氧末端终止法及SSCP法的原理，它将ropB基因片段复制产物做模板直接加入用于产生类似DNA测序产物的有放射性标记的不同长度的双脱氧末端片段，再行SSCP，经放射自显影后得出针对不同突变的特异的ddF。

这样，如果有ropB基因突变，在SSCP电泳中不仅可以从因单链构象改变产生的泳动距离差异在SSCP中得以鉴别，同时由于其双脱氧末端终止位点不同于标准株，双脱氧末段片段数目也不同而得以区分。

Felmee检测出了有不同突变的所有多耐药菌株，每一突变均有特异的ddF。

在与SSCP分析法的对比研究中，认为ddF方法可以克服SSCP结果受电泳条件、电泳时间影响大，受突变性质影响大及不能区分出，在时间和成本上都有优越性，但未见有进一步临床应用情况的报道。

4异源双链形成法HDF可用于检测DNA单个碱基突变或缺失，原理为突变基因与无突变基因PCR扩增产物混合，变性后使其温度缓慢下降，部分可形成分别来源于突变与敏感株基因的异源双链，同时有部分形成同源双链，电泳后可将二者区分开来，并且突变不同，形成的异源双链迁移距离也不同。

Williams用HDF法进行了结核杆菌利福平ropB突变检测的尝试，110株RFP耐药株经HDF检测得到多条带形，证明有异源双链形成，而敏感株则只形成一条同源双链，HDF法与DNA测序法符合率达100％。

这种方法操作简便，判定容易，不需放射性标记，适合应用于临床，但有关报道较少。

5反向系列探针杂交法LiPA方法基于探针杂交原理，先设计合成一系列探针，覆盖整个ropB突变高发区，其中S系列探针针对野毒株序列，R系列探针含数个有常见突变序列的探针，还可以设计一个有种属特异性的探针，将这一系列探针顺次固定于同一杂交膜上，在严格条件下与亲和素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出突变有无及大致位置。

这种杂交方法可以同时进行种属鉴定，检测试剂盒已有厂家生产，结果判定容易，特异性高，易于标准化。

如Beenhouwer[10]应用此法对临床痰标本的检测中与药敏结果对照有97％的符合率。

最近有学者[11]应用此法同时对结核分支杆菌进行种属鉴定及PCR敏感性测定，特异性达100％，对107株已知序列的结核杆菌临床分离株测定中，61株敏感株全部显示敏感型杂交带谱，203株耐药株除4株外均检测到突变带谱，误诊率下降到％。

不足之处是操作复杂，成本较高。

　　以上分子生物学方法对结核杆菌RFP耐药性检测应用中均有快速、准确，特异等优点，可在72h内报告结果，可以满足早期临床诊治需要，是结核杆菌RFP耐药性测定发展必然趋势。

下一步研究重点是提高临床标本ropB基因扩增特异性，技术条件标准化、规范化，以及将耐药性诊断及种属鉴定同时进行的方法，使其能够成为直接应用于临床的有效方法。

　　参考文献

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