临床免疫学自身抗体检测及应用Word格式文档下载.docx

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患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。

　　产生自身抗体的抗原包括以下几种：

化学修饰的组织抗原；

与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原；

隐蔽抗原；

自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等，在一定条件下，均可刺激机体产生自身抗体。

自身抗体与疾病的关系：

某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性，已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体；

某些自身抗体与疾病的活动性有相关性；

少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。

　　测定自身抗体的意义：

自身免疫性疾病的诊断；

疾病活动性的判断；

疗效的观察；

指导临床用药等。

第二节　常见自身抗体的检测

　　自身抗体种类很多，这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。

　　一、类风湿因子

（一）概念

　　类风湿因子（rheumatoidfactor，RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。

可与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集，最多见于类风湿性关节炎患者。

　　Rose等1984年在RA（rheumatoidarthritis）患者血清中发现RF。

RF有IgM、IgG、IgA和IgE型，IgM型为主要类型。

（二）检测方法

　　1.胶乳凝集试验：

以IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上，如血清中含有RF，可与乳胶颗粒出现凝集反应。

该法只能定性或半定量，灵敏度及特异性不高，只能检测IgM型RF。

　　2.速率散射比浊法：

定量检测、准确、快速，准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。

也只能检测IgM型RF。

　　3.ELISA法：

可检出不同Ig类型的RF，在酶标记抗体时，分别标记IgG、IgA或IgM。

　　（三）临床应用

　　RF主要见于类风湿，在类风湿性关节炎患者中的检出率很高，RF阳性支持早期RA的倾向性诊断，对年轻女性应进行RA和风湿热的鉴别；

而对非活动期RA的诊断，需参考病史。

但RF也像ANA一样，并不是RA独有的特异性抗体。

在SLE患者约有50%RF阳性，在其他结缔组织病如SS、硬皮病、慢性活动性肝炎以及老年人中均可有不同程度的阳性率。

部分正常人也可出现。

但RF滴度或含量一般较低（<

40IU／ml）。

RF无严格特异性，不是RA的唯一诊断标准。

RF阴性不能排除RA。

　　IgM型RF：

>

80IU／ml伴严重关节功能障碍者，提示预后不良。

　　IgG型RF：

与患者滑膜炎、血管炎和关节的症状密切相关。

正常人以及非RA患者中很难检出。

　　IgA型RF：

10%RA可检出，为RA临床活动的指标，与骨质破坏以及关节炎症状的严重程度显著相关。

　　IgE型RF：

在关节液、胸水中高于血清水平。

　　二、抗核抗体

　　抗核抗体（antinuclearantibody，ANA）是以自身真核细胞成分作为靶抗原的一组自身抗体的总称，泛指各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。

迄今已发现20余种。

性质主要是IgG，也有IgM、IgA、IgD和IgE，可与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。

ANA主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液以及尿液等体液中。

　　ANA可见于多种疾病，主要存在于自身免疫性疾病患者血清中，如SLE、SS、MCTD、类风湿性关节炎等。

也可见于慢性肝病、病毒感染以及正常老年人、妊娠妇女等。

ANA阴性不能排除自身免疫性疾病的诊断；

阳性也不一定是自身免疫性疾病。

　　由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；

因此就会有多种不同类型的ANA。

ANA在不同的疾病中呈现不同的组合，不同的疾病有自己的抗核抗体谱。

有些ANA只是针对某一特定成分，只在某一疾病中出现，成为该病的血清标志性抗体。

ANA是一个重要的筛选试验。

　　分类：

按理化特性和抗原分布部位分为四大类。

包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体。

　　命名：

　　1.根据抗原化学名称命名：

例如抗dsDNA、抗RNP。

　　2.以第一位检出患者命名：

例如抗Sm、抗Ro、抗La抗体。

　　3.以相关疾病命名：

例如抗SSA、抗SSB抗体。

（一）检测方法

　　由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。

目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。

　　常用间接免疫荧光法（indirectimmunofluorescence，IIF）作为总的ANA筛选试验。

鼠肝常用于检测抗核抗体，但近十年来多被HEp-2细胞所代替，这是因为HEp-2细胞具有以下特点：

人源性；

细胞核大；

分裂期细胞多；

可大批量培养。

当然，单个细胞不可能替代组织切片，所以鼠组织切片仍继续用于自身抗体的检测。

　　放射免疫法：

常用于检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。

①Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。

②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45μm）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。

　　ELISA法：

临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。

目前已有试剂盒供应。

　　免疫印迹（immunoblotting）法：

先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酶标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析。

由于该试验不需纯化的单个抗原，可在同一固相上作多项分析检测，灵敏度高，特异性强。

故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测，如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。

　　另外，还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。

这些试验要求的实验条件比较低，但敏感性也比较低。

　　均质型

　　斑点型

　　核仁型

　　核膜型

（二）常见ANA荧光图形及临床意义

　　1.均质型：

多是由抗DNP抗体所引起。

也可由核小体抗体和抗双链DNA抗体引起。

主要见于SLE，药物性狼疮。

　　2.斑点型：

是由抗ENA抗体所引起。

主要见于SLE、MCTD、PSS、SS等。

高滴度的斑点型常见于MCTD。

　　3.周边型（又称核膜型）：

主要由抗dsDNA的抗体所引起。

主要见于SLE。

特别是活动期患者。

　　4.核仁型：

主要见于硬皮病。

相关抗体是抗核仁特异的低分子量RNA等。

　　5.着丝点型：

主要见于局限性硬皮病及CREST综合征。

主要的靶抗原是着丝点B抗原。

　　（三）抗双链DNA抗体的检测方法

　　检测抗DNA抗体的方法有多种，如ELISA、IIF、金标法、免疫印记法、放免法等。

其中最特异敏感的是应用锥虫或血鞭毛虫（如绿蝇短膜虫）作基质测定抗dsDNA抗体。

因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；

在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。

因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。

另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。

　　抗dsDNA抗体是SLE的特征性标记抗体，是SLE活动期的重要指标。

抗体滴度的动态检测对疗效的监测提供了有价值的实验室手段。

抗dsDNA抗体对诊断SLE特异性较高；

可达95%以上，但敏感性较低，仅为30%～50%，因此，抗dsDNA抗体阴性不能排除SLE的诊断。

　　抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起到重要作用。

如狼疮肾炎；

血管炎；

皮肤的蝶形红斑等均与该抗体有关。

　　三、抗ENA抗体谱

（一）概述

　　ENA（extractablenuclearantigens）是可提取性核抗原的总称。

ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒。

ENA主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scb-70等抗原。

不同的自身免疫病可以产生不同的抗ENA抗体。

ENA抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。

　　检测方法有多种，如免疫印迹法（immunoblotting，IBT）、ELISA、对流免疫电泳、双扩散、金标法等。

这里主要介绍免疫印迹技术。

　　免疫印迹技术属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。

其基本原理为从小牛或兔胸腺提取ENA，经过SDS-PAGE电泳分成区带，然后转印至硝酸纤维膜上，将待检血清（含抗ENA抗体）加在硝酸纤维膜上，抗ENA抗体与ENA抗原结合，形成Ag-Ab复合物，加入酶标抗人IgG，形成Ag-Ab-酶标Ab复合物，然后加入底物显色。

与标准条带对比判读，可以确定不同的抗ENA抗体。

　　免疫印迹技术不需纯化抗原，灵敏度高，特异性强，操作简便，是广泛采用的检测抗ENA抗体的技术。

　　图1ENA自身抗体谱标准对照带

　　（三）抗ENA抗体的临床意义

　　1.抗Sm抗体：

是SLE的血清标志抗体，阳性率30%～40%。

阴性不能排除SLE的诊断。

抗Sm抗体水平与SLE活动性没有相关性，也不与临床表现相关，治疗后的SLE患者也可呈现抗Sm抗体阳性。

抗Sm抗体的检测对早期或不典型的SLE以及治疗后的SLE的回顾性诊断具有帮助。

　　2.抗核RNP抗体：

高滴度的抗核RNP（nRNP）抗体是MCTD诊断的重要依据。

因其抗原为含有U1RNA的核蛋白复合物，故称U1RNP。

MCTD阳性率可高达95%。

也可见于其他自身免疫性疾病。

因为Sm与RNP为同一分子复合物（RNA-蛋白质颗粒）中的不同抗原位点，因此两种抗原具有相关性，常伴随出现，单一的抗Sm抗体阳性者较少见。

　　3.抗SSA／Ro／抗SSB／La：

是干燥综合征（SS）最常见的自身抗体，抗SSB特异性较SSA高。

两者同时检测可提高SS的诊断率，抗SSA抗体也可见于SLE和其他自身免疫病，亚急性红斑狼疮患者、补体缺陷的SLE患者、新生儿狼疮患者可以出现抗SSA抗体。

IgG类抗SSA抗体通过胎盘进入胎儿后，可引起新生儿狼疮综合征，出现典型的SLE皮损。

抗SSA抗体与胎儿的心脏传导系统结合，可以造成先天性心脏传导阻滞。

　　4.抗Jo-1抗体：

最常见于多发性肌炎（polymyositis，PM）。

在其他AID一般为阴性。

PM与硬皮病重叠者阳性率较高。

　　5.抗Scl-70抗体：

几乎仅见于进行性系统性硬化病（progressivesystemicsclerosis，PSS），阳性率40%～60%，其他AID少见，是PSS的标志性抗体。

正常人为阴性。

　　四、抗中性粒细胞胞浆抗体

　　抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophilcytopl