质粒DNA的提取及检测PPT资料.ppt

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细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化返回目录,二原理,碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：

在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；

将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。

通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：

线形、开环、闭环超螺旋。

返回目录,原理示意图返回目录返回原理,三、实验仪器、材料与试剂,

（一）仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅

（二）材料：

含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌、（三）试剂：

LB培养基（液体、固体）溶液I溶液II溶液IIITE（pH8.0）,器材,1.恒温摇床2.超净工作台3.离心机4.电泳仪和电泳槽5.玻璃器皿与耗材量筒、三角瓶、平皿;

EP管（1.5ml,0.5ml）;

枪头（1ml,0.2ml,10l）;

牛皮纸、纱布、牙签等返回目录,试剂,1.LB培养基detail2.溶液Idetail3.溶液detail4.溶液IIIdetail5.TE（pH8.0）detail返回目录,LB培养基back,配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：

细菌培养基用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g细菌培养基用酵母提取物（bacto-yeastextract）5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH（约0.2ml）调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2（1.034105Pa）高压下蒸汽灭菌20分钟。

溶液Iback,50mmol/L葡萄糖25mmol/LTrisCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）在10lbf/in2（6.895104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4。

作用：

分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活,溶液IIback,0.2mol/LNaOH（从5mol/L贮存液中现用稀释）1%SDS作用：

细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。

溶液IIIback,5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。

酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA,0.5mol/LEDTA（pH8.0）,在800ml水中加入186.1gEDTA-Na2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0（约20gNaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌。

1mol/LTrisCl（pH8.0）,在800ml水中加入121.1gTris-base，溶解后加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1L，分装后高压灭菌。

TE（pH8.0）back,10mmol/LTrisCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）作用：

稳定,四、实验步骤,接含pUC18（或pET21a）质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5ml菌液入1.5ml的离心管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体,加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：

氯仿：

异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：

异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min,12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）12000rpm，离心10min晾干沉淀沉淀用20ulTE溶解，-200C保存,四操作步骤,挑选一个单菌落，接种到含适当抗生素的3mlLB培养液中，37振荡培养1416小时。

取1.2ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。

加入溶液I100l，涡旋振荡充分悬浮、分散混匀（重悬细胞）。

加入200l溶液（现配），立即上下颠倒次，室温放置分钟（冰浴更佳），直至溶液澄清（使细菌裂解、染色体DNA、蛋白质变性）。

加入溶液IIIl，轻柔颠倒510次，室温放置分钟（冰浴更佳）（利用pH差异，复性质粒DNA）。

返回目录,四操作步骤,12,000rpm离心10分钟，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白。

将上清液全部转移到柱子里（注意：

不要吸取沉淀，否则会有核污染），室温放置分钟（可长可短）12,000rpm离心1分钟。

取下柱，弃去外收集管中的废液，放回柱，加入ulWashSolution,高速离心分钟；

重复上述步骤次；

取下柱，弃去外收集管中的废液，放回柱，高速离心分钟；

将柱放入干净的.mL离心管中,向柱膜中央加ulTE（预热到）,室温放置分钟，盖紧管盖，高速离心分钟；

所得质粒即可用于酶切、电泳或放冻存。

返回目录,分次收集4ml菌液离心，留沉淀,第二部分琼脂糖凝胶电泳,相关知识,电泳：

泳动速度决定于？

琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。

而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。

琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型DNA的移动速度依次为：

共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

影响迁移率的因素,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。

常用染料,EB:

溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。

DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。

EB染料优点：

染色操作简便，快速，室温下15-20min；

不会使核酸断裂；

灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；

可以加到样品中可胶中。

EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。

EB废液要经过处理才能丢弃。

SYBR:

新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。

一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

二、实验原理,DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。

在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。

可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。

三、仪器、材料与试剂,

（一）仪器：

稳流稳压电泳仪

（二）材料1.自已提取的质粒DNA2.相对分子质量标准品（三）试剂15TBE储液（pH8.0）使用时稀释10倍，成0.5TBE（1TBE也可）。

2凝胶加样缓冲液0.2%溴酚蓝，50%蔗糖3.琼脂糖4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4保存。

用时稀释成5ug/ml的EB。

常用的电泳缓冲液,4保存备用.,四操作步骤,琼脂糖（1%）凝胶电泳称取一定量琼脂糖凝胶，按1g中100ml的量加入电泳缓冲液，微波炉中加热约2min，使琼脂糖溶解；

溶液冷至60，加入EB至终浓度为0.5g/ml，混匀，注意戴手套操作；

将琼脂糖倒入电泳板中，使凝胶厚度约为0.3-0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡；

待凝胶完全凝固后（约30min），小心取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳buffer，让液面高出胶面1mm；

在DNA样品（ul）中加入1/6loadingbuffer，混匀后用移液枪将样品加入样品孔中电泳，电压降选择为1-5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）；

根据指示剂的位置，判断是否终止电泳;

在紫外灯下凝胶成像仪上观察电泳结果。

返回目录,五、实验结果与讨论,根据观察结果，绘图。

分析自提质粒的情况。

pGFPpBSKM,图1的电泳结果不是很好，一方面上样量太大不同构象的质粒分子没有分开；

另一方面有些样品RNA去除得不好，在电泳结果上可以看到大团的荧光；

此外还要注意上样的技巧，上样后稍沉降一会，使样品均匀地分布于上样孔的底部再开始电泳，这样走出的条带会较均匀。

图3的结果较好。

六注意事项,为提高质粒产量，要注意下面两个步骤：

加入溶液I后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮；

加溶液II裂解要完全（快速轻柔颠倒510次），使蛋白质和核酸变性；

加溶液III后pH要达到中性（轻柔振荡510次），使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。

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