小鼠SOIX基因的重组等实验设计论文.docx
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小鼠SOIX基因的重组等实验设计论文
小鼠SOIX基因的重组等实验设计
一、实验前准备
(一)目标基因:
小鼠SOXI基因
(二)基因BANK上的查询
1.
2.
3.
(三)选用pGEM®-TEasy载体
说明
pGEM®-TEasy载体系统是克隆PCR产物的方便系统。
它除了具有pGEM®-T载体系统(Cat.#A3600,A3610)所有的优势外,在插入位点两侧分别有EcoRI和NotI酶切位点,便于通过选择单酶切释放插入的DNA。
pGEM®-TEasy载体系统II除了pGEM®-TEasy载体系统I所有成分外,还包括JM109感受态细胞。
特点
●灵活:
pGEM®-TEasy载体多克隆位点两侧分别有BstZI,EcoRI和NotI酶切位点,便于通过选择单酶切释放插入的DNA。
●快速连接:
使用2X快速连接缓冲液(2XRapidLigationBuffer)可以使连接反应在室温下1小时内完成。
●.蓝/白筛选:
载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子,分别位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内多克隆位点的两侧。
α-肽的插入失活允许在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆。
●.f1复制起始位点:
可用于制备单链DNA。
(四)DNAMAN
1.
2.
3.
4.
至此确定引物分别为:
上游引物P1:
5’—TAAGCTTATGFACAGCATGATGATGGAG一3’,(含ApaI酶切位点,GGGCCC)
下游引物P2:
5’一GGAATFCCTAGATGTGCGTCAGGGGCAC一3’(含SphI酶切位点,GCATGC)
引物可以找公司合成。
2、具体实验步骤
(1)总体实验流程图
Trizol法提取小鼠目的基因mRAN
RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认
感受态细胞的制备
质粒DNA的提取及浓度测定
重组蛋白表达及目的蛋白的免疫印迹鉴定
图1实验设计流程图
(2)目的基因提取
1.实验前准备
材料:
孕育第8天的小鼠
设备:
研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。
试剂:
(1)无RNA酶灭菌水:
用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。
(2)75%乙醇:
用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。
(3)1×层析柱加样缓冲液;20mmol/LTris·Cl(pH7.6),0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%SDS。
(4)洗脱缓冲液:
10mmol/LTris·Cl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.05%SDS。
2.操作步骤
(1)小鼠总RNA的提取
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交,Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
孕第8天的小鼠用断颈法处死后在无菌条件下取其胚胎组织。
1 将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2 研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3 取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4 弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5 小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]
●整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
●加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
(2)小鼠mRNA的提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
1 用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo(dT)纤维素。
2 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3 用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
4 将中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5 测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6 测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。
7 加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
8 4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
9 小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
10 用少量水溶解RNA液,即可用于逆转录合成cDNA(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
[注意]
●mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
●oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。
每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床
(三)RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认
1.实验前准备
材料:
实验步骤
(二)所得的目的基因的总mRAND的cDNA,和实验前已经查询好的两种引物。
仪器:
冷冻台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、移液器、灭菌枪头、1.5mL灭菌离心管、0.5mL灭菌离心管、0.2mL灭菌PCR管、灭菌剪刀、灭菌大镊子、液氮、碎冰。
试剂:
1 RNA制备所需的试剂和溶液(见实验二)。
2 逆转录酶及其缓冲液,直接购于公司。
3 OligodT(16):
经公司合成的干粉溶于灭菌的重蒸水中,配成10μmol/L,–20℃冻存。
4 2.5mmol/LdNTP
5 TaqDNA聚合酶及其缓冲液
6 10×TAE电泳缓冲液:
1L含48.4gTris,11.4mL冰乙酸,7.4gNa2EDTA
7 DNA上样缓冲液:
50%甘油,0.25%溴酚兰,4℃储存或-20℃冻存
8 溴化乙锭:
配制成10mg/mL母液,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可
9 琼脂糖、DNA分子标准、灭菌的重蒸水
2.具体实验步骤
(1)总RNA的浓度测定
取出部分所提取的总RNA(体积视比色皿的大小而定),用去离子水稀释200倍,测定OD260、OD280。
如果OD260/OD280大于1.8,则认为所提取的RNA比较纯。
OD260=1相当于RNA的浓度为40μg/mL,计算总RNA的浓度。
(2)提取出的总RNA经普通琼脂糖电泳检测,通过观察总RNA的18S、28S特征条带鉴定总RNA的质量。
(3)取高质量的总RNA进行逆转录。
反应在0.5mL灭菌离心管中进行,10μl逆转录体系包括:
DEPC水1.5μL
Rnase抑制剂0.5μL
总RNA4μL(总量1μg)
oligodT(16)(10μmol/L)0.5μL
dNTP(10mM)1μL
5×逆转录缓冲液2μL
逆转录酶0.5μL
在加入后三种成分前,混合物先在65℃加热5min后,迅速放置冰上,使RNA充分变性并和引物充分结合。
加入逆转录酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中。
酶从冰箱取出后放置在冰上,使用完毕,应立即放回冰箱。
(4)在逆转录酶指定的温度下(一般为42℃左右)进行逆转录反应,反应时间一般为90min。
反应完毕后,70℃下10min,对酶进行灭活。
反应产物于–20℃冻存。
(5)以上述逆转录的cDNA作为模板进行PCR反应。
总体积为50uL,在0.2mL灭菌的PCR管中依次加入:
灭菌的重蒸水37.5µL
10×Taqbuffer5µL
2.5mmol/LdNTP2µL
P1(10μmol/L)2µL
P2(10μmol/L)2µL
cDNA1µL
Taq酶0.5µL
加入Taq酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中。
酶从冰箱取出后放置在冰上,使用完毕,应立即放回冰箱。
(6)将上述PCR管放入PCR仪中,设计程序:
94℃预变性3min,然后将下列三个步骤进行35个循环:
94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,最后于72℃下保温10min。
(7)取10μLPCR产物,用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
(8)经电泳鉴定大小正确后,可继续交送公司测序。
将测序的序列与NCBI上的序列进行比较,确定是否为小鼠SIOX基因。
(四)感受态细胞的制备
用物理或者化学的方法处理细菌细胞,能让细胞处于一种容易吸收外源DNA的状态,即感受态。
制备感受态的方法和多,如CaCl2法、特殊试剂诱导法、原生质体法、电击法等。
转化是将外源DNA分子引入受体细胞的过程,所用的受体细胞一般是不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ)。
CaCl2转化法的原理是由于细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,外源DNA与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经热激处理后,菌体细胞膜通透性发生改变,从而吸收DNA复合物。
CaCl2转化法在细菌的转化研究工作中得到了广泛的应用和不断的改进,使不同菌株的转化效率大大提高。
本实验以大肠杆菌JM109菌株为受体细胞,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。
由于pBS质粒(图1)带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS质粒(含有pGEM®-TEasy载体),则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pBS质粒。
转化子繁殖后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。
1.实验前准备
材料
大肠杆菌JM109菌株(菌液中加入50%甘油,冻存-70℃,可供下次使用)、pB