小鼠SOIX基因的重组等实验设计论文.docx

1、小鼠SOIX基因的重组等实验设计论文 小鼠SOIX基因的重组等实验设计 一、实验前准备（一）目标基因：小鼠 SOXI基因（二）基因BANK上的查询1.2.3.（三）选用pGEM-T Easy 载体 说明 pGEM-T Easy 载体系统是克隆PCR 产物的方便系统。它除了具有pGEM-T 载体系统(Cat.# A3600, A3610) 所有的优势外，在插入位点两侧分别有EcoRI 和NotI 酶切位点，便于通过选择单酶切释放插入的DNA。pGEM-T Easy 载体系统II 除了pGEM -T Easy载体系统I 所有成分外，还包括JM109 感受态细胞。特点 灵活：pGEM-T Easy

2、载体多克隆位点两侧分别有BstZI, EcoRI和NotI 酶切位点，便于通过选择单酶切释放插入的DNA。 快速连接：使用2X 快速连接缓冲液(2X Rapid Ligation Buffer)可以使连接反应在室温下1 小时内完成。 .蓝/ 白筛选：载体包含有T7 和SP6 RNA 聚合酶启动子，分别位于 - 半乳糖苷酶的 - 肽编码区内多克隆位点的两侧。 - 肽的插入失活允许在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆。 .f1 复制起始位点：可用于制备单链DNA。（四）DNAMAN1.2.3.4.至此确定引物分别为：上游引物P1：5TAAGCTTATGFACAGCATGATGATGGAG一3，（含

3、ApaI酶切位点，GGGCCC）下游引物P2：5一GGAATFCCTAGATGTGCGTCAGGGGCAC一3（含SphI酶切位点，GCATGC）引物可以找公司合成。2、具体实验步骤（1）总体实验流程图Trizol法提取小鼠目的基因mRANRT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认感受态细胞的制备质粒DNA的提取及浓度测定重组蛋白表达及目的蛋白的免疫印迹鉴定图1 实验设计流程图（2）目的基因提取1.实验前准备材料：孕育第8天的小鼠设备：研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。试剂：（1）无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后

4、加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 （2）75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 （3）1层析柱加样缓冲液；20mmol/L TrisCl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。（4）洗脱缓冲液：10mmol/L TrisCl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。2.操作步骤 (1)小鼠总RNA的提取Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Tri

5、zol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。孕第8天的小鼠用断颈法处死后在无菌条件下取其胚胎组织。1将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 2研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 3取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分

6、钟。 4弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。5小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。（2）小鼠mRNA的提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲

7、液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。 1用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 2将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4将中提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入

8、柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。5测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。 7加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -2030分钟。 84下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4下12000g离心5分钟。9小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。 10用少量水溶解RNA液，即可用于逆转录合成cDNA（或保存在70%乙醇中并贮存于-70）。 注意 mRNA在70

9、%乙醇中-70可保存一年以上。 oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床（三）RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认1.实验前准备材料：实验步骤（二）所得的目的基因的总mRAND的cDNA，和实验前已经查询好的两种引物。仪器：冷冻台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、 紫外检测仪、移液器、灭菌枪头、1.5 mL灭菌离心管、0.5 mL灭菌离心管、0.2 mL灭菌 PCR管、灭菌剪刀、灭菌大镊子、液氮、碎冰。

10、试剂：1RNA制备所需的试剂和溶液（见实验二）。2逆转录酶及其缓冲液，直接购于公司。3OligodT（16）：经公司合成的干粉溶于灭菌的重蒸水中，配成10 mol/L，20冻存。42.5 mmol/L dNTP5Taq DNA聚合酶及其缓冲液610TAE电泳缓冲液：1 L含48.4 g Tris，11.4 mL 冰乙酸，7.4 g Na2EDTA7DNA上样缓冲液：50%甘油，0.25%溴酚兰，4储存或-20冻存8溴化乙锭：配制成10 mg/mL母液，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可9琼脂糖、DNA分子标准、灭菌的重蒸水2.具体实验步骤（1）总RNA的浓度测定取出部分所提取的总RNA（体积视

11、比色皿的大小而定），用去离子水稀释200倍，测定OD260、OD280。如果OD260 / OD280 大于1.8，则认为所提取的RNA比较纯。OD260=1相当于RNA的浓度为40g/mL，计算总RNA的浓度。（2）提取出的总RNA经普通琼脂糖电泳检测，通过观察总RNA的18S、28S特征条带鉴定总RNA的质量。（3）取高质量的总RNA进行逆转录。反应在0.5 mL灭菌离心管中进行，10l逆转录体系包括：DEPC水 1.5 LRnase抑制剂 0.5 L总RNA 4 L（总量1g ）oligo dT（16）（10mol/L） 0.5 LdNTP (10 mM) 1 L5逆转录缓冲液 2 L

12、逆转录酶 0.5 L在加入后三种成分前，混合物先在65加热5 min后，迅速放置冰上，使RNA充分变性并和引物充分结合。加入逆转录酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中。酶从冰箱取出后放置在冰上，使用完毕，应立即放回冰箱。（4） 在逆转录酶指定的温度下（一般为42左右）进行逆转录反应，反应时间一般为90 min。反应完毕后，70下10 min，对酶进行灭活。反应产物于20冻存。（5）以上述逆转录的cDNA作为模板进行PCR反应。总体积为50 uL，在0.2 mL灭菌的PCR管中依次加入： 灭菌的重蒸水 37.5 L 10Taq buffer 5 L 2.5 mmo

13、lL dNTP 2 L P1（10 molL） 2 L P2（10 molL） 2 L cDNA 1 LTaq酶 0.5 L加入Taq酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中。酶从冰箱取出后放置在冰上，使用完毕，应立即放回冰箱。（6）将上述PCR管放入PCR仪中，设计程序：94预变性3 min，然后将下列三个步骤进行35个循环：94变性1 min，55退火1 min，72延伸1 min，最后于72下保温10 min。（7）取10 L PCR产物，用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。（8）经电泳鉴定大小正确后，可继续交送公司测序。将测序的序列与NCBI上的序列进

14、行比较，确定是否为小鼠SIOX基因。（四）感受态细胞的制备用物理或者化学的方法处理细菌细胞，能让细胞处于一种容易吸收外源DNA的状态，即感受态。制备感受态的方法和多，如CaCl2法、特殊试剂诱导法、原生质体法、电击法等。转化是将外源DNA分子引入受体细胞的过程，所用的受体细胞一般是不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R，M）。CaCl2转化法的原理是由于细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经热激处理后，菌体细胞膜通透性发生改变，从而吸收DNA复合物。CaCl2转化法在细菌的转化研究工作中得到了广泛的应用和不断的改进，使不同菌株的转化效率大大提高。本实验以大肠杆菌JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒（图1）带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ），可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS质粒（含有pGEM-T Easy 载体），则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS质粒。转化子繁殖后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。1实验前准备材料大肠杆菌JM109菌株（菌液中加入50甘油，冻存70，可供下次使用）、pB