离子液体及其在蛋白质结晶中的研究应用Word格式文档下载.docx

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自从2000年离子液体用于酶催化反应以来,离子液体表现出的优良性能使其在生物化学领域的研究逐渐普及、深入,目前其主要的应用包括生物催化、生物传感器以及蛋白质的稳定性[5]等研究,这些研究为进一步开展离子液体在蛋白质结晶中的应用提供了理论基础和实验依据,为蛋白质结晶学的发展提供了一种新的技术手段。

本文在综述了离子液体的种类、性质等背景的基础上,重点介绍了近年来离子液体用于蛋白质结晶的研究现状,以期为今后这方面的应用提供参考。

1离子液体

离子液体种类繁多,根据有机阳离子的不同可以将离子液体分为四大类[6],分别是:

咪唑盐类、吡啶盐类、季铵盐类和季膦盐类,其中前两种较为常见。

常用的阴离子主要有卤素离子、A1Cl4-和含氟、磷、硫的多种离子,如BF4-、BF6-、PF6-、CF3SO3-、CF3COO-、PO43-、NO3-、SbF6-等,阴离子的种类和性质与离子液体的溶解性能密切相关[7]。

由于离子液体独特的结构,其性质与其他传统有机溶剂有所差别。

如:

①粘度大,比传统有机溶剂的粘度要高1～3个数量级[8];

②几乎没有蒸汽压、不易挥发,并且对环境比较友好,消除了有机挥发试剂对环境的污染;

③对有机物、无机物均有良好的溶解性能;

④具有较好的热稳定性和抗氧化性等等。

这些独特的性质为离子液体在蛋白质结晶领域的应用提供了有利的条件。

2在离子液体体系中生长蛋白质晶体的意义

生物大分子种类繁多而且结构复杂,如何准确测量这些生物大分子的三维结构,从而进一步探索其生物功能具有重要的研究意义[9]。

蛋白质晶体学目前是得到生物大分子精细结构的主要技术,但是由于生物大分子本身的特殊性,获得适合X-射线衍射分析的蛋白质晶体仍然具有很大的挑战性。

多数蛋白质的结晶方法都具有一定的局限性,只适用于特定的实验对象,对其它蛋白质甚至具有相似特性的蛋白质的结晶过程都不具有普遍性。

近年来,将离子液体应用于蛋白质结晶的研究初露端倪,并取得了良好的实验结果,有望攻克结晶学的很多难题。

在离子液体体系中生长蛋白质晶体的意义可以总结为以下几个方面。

2.1优化结晶条件、提高晶体质量

离子液体的结构具有很大的设计性,通过修饰或变换阴阳离子的结构或种类可以调控离子液体的物

理化学性质[10]（pH值、离子强度、离子表面的亲疏水性等）,根据蛋白质的种类和特点,设计有利于其结晶的离子液体,从而对蛋白质的结晶过程进行优化控制,以满足特定的应用需求[11]。

离子液体的低挥发性,可延缓溶液中水分扩散的速率,降低溶液的过饱和度,从而减慢晶体的成核和生长速度,使蛋白质单晶缓慢地从溶液中析出,避免了多晶的生成,得到质量较好的晶体[12]。

而且利用离子液体所培养得到的蛋白质晶体其衍射强度高,重复性好,更适合用于X-射线衍射分析。

2.2为某些疑难蛋白的结晶提供可能

蛋白质的溶解性与离子液体阳离子基团的侧链长度有关,某些在水溶液中溶解性较差的蛋白质在离子液体中会有良好的溶解性能,而且蛋白质的热稳定性也能在特定结构的离子液体中得到提高。

目前,离子液体的组成不仅仅限于常规的有机或无机阴阳离子,还有一些具有生物性能的基团,比如氨基酸、胆碱[13]等等,这些离子液体具有良好的生物兼容性。

一些带有疏水基团的蛋白质在水中的溶解度较小,很难得到适合X-射线衍射的晶体,离子液体就为这类蛋白质特别是膜蛋白的结晶提供了可能[11]。

2.3为蛋白质分离纯化提供一种新的技术手段

以离子液体作为添加剂在溶菌酶的结晶过程中可以在有大量杂质存在下（如高浓度卵清蛋白）得到质量较好的晶体。

利用离子液体这个独特的优点,可以在不加入任何晶种的前提下实现鸡蛋蛋清中溶菌酶的结晶,并且得到的溶菌酶晶体具有较高的活性和纯度,由此为蛋白质分离纯化提供了一种新的技术手段[12]。

3离子液体在蛋白质结晶中的应用

目前离子液体用于蛋白质结晶主要有两种方式,一种是作为添加剂,一种是作为沉淀剂。

绝大多数的研究是将离子液体作为添加剂使用,这部分工作已经取得了良好的效果,离子液体作为沉淀剂的研究相对较少,而且效果也不十分突出。

3.1离子液体作为沉淀剂用于蛋白质结晶

1999年Borgstahl等人[14]首次将亲水性离子液体硝酸乙胺作为沉淀剂用于溶菌酶的结晶,实验发现离子液体加入后能够提高溶菌酶在液相中的稳定性和单分散性。

晶型随着pH值变化而变化,维持pH值在4.5到4.6之间可以得到单斜晶体,在5.4到5.6之间可以得到四方晶体,而且当离子液体浓度较低时,溶菌酶仍保持原来的结构和活性。

Borgstahl认为蛋白质中疏水性较强的配体在硝酸乙胺中比在水中有更好的溶解性能,因此离子液体在蛋白质结晶中具有较大的应用潜力。

Judge等人[15]采用一系列不同阴阳离子组合的离子液体作为沉淀剂研究六种目标蛋白质（溶菌酶、过氧化氢酶、肌红蛋白、胰蛋白酶、葡萄糖异构酶、木聚糖酶）的结晶行为,只有胰蛋白酶和溶菌酶在部分结晶条件下得到了晶体。

由此可见,虽然离子液体相对于其它结晶试剂对蛋白质有较好的溶解性能,但是目前作为沉淀剂效果不佳,因此这方面的研究相对较少。

3.2离子液体作为添加剂用于蛋白质结晶

Pusey等人[11]采用三种咪唑类离子液体作为添加剂研究了刀豆球蛋白、β-乳球蛋白B、木聚糖酶和葡萄糖异构体四种蛋白质的结晶过程。

对比离子液体添加前后几种目标蛋白的结晶情况,离子液体对结晶的改善作用主要有两点:

①优化了结晶条件,得到优秀实验结果的概率大大提高;

②晶体质量明显提升,晶体尺寸增大,晶型也有很大程度的改善。

为了进一步研究离子液体种类对蛋白质结晶的影响,Hekmat等人[16]用5种不同种类的亲水性离子液体作为添加剂进行溶菌酶的结晶。

实验选取的离子液体阴离子分别为甲酸根、硝酸根、醋酸根、羟乙酸根和磷酸根,阳离子为碳链不同、中心分别为伯铵、仲铵、叔铵和季铵阳离子。

研究发现离子液体能够显著改善晶体生长的动力学行为,提高晶体生长速率,在没有离子液体时,晶体的生长时间需要22h,加入甲酸根型和硝酸根型离子液体后生长时间缩短为4h;

而且甲酸根型、硝酸根型和磷酸根型离子液体可以消除常规结晶条件下出现的海胆状晶体,抑制晶体生长过程中的多晶态现象。

阴离子对结晶结果的影响较大,在阳离子相同的情况下,甲酸根离子和羟乙酸根离子比硝酸根离子更适合作为添加剂。

很多实验证明离子液体与生物大分子之间存在强烈的相互作用[17],基于此Chen等人[12]采用离子液体1,3-二丁基咪唑氯代盐BBimCl作为添加剂,研究了其对鸡蛋溶菌酶结晶的影响。

研究发现加入离子液体之后,不仅能够优化晶体的形貌、增大晶体的尺寸,而且即使在沉淀剂浓度很高的情况下仍然得到质量较好的晶体,避免了高盐浓度下多晶态和蛋白质沉淀的现象;

同时无论从成核方面还是生长方面都延缓了晶体形成的时间,这与Hekmat等人[16]研究的离子液体能够加快晶体生长的结果不同,这可能与所用离子液体种类、性质以及蛋白质种类有关。

将离子液体作为添加剂得到的溶菌酶结晶进行X-射线衍射,分析结果表明离子液体的加入不会对溶菌酶晶体的空间构象产生影响,但离子液体的阳离子BBim+进入到了晶体结构中,并与溶菌酶分子主链上的Trp62、Trp63和Asp101之间存在相互作用。

离子液体在蛋白质结晶过程中对晶体的影响不仅表现在提高晶体的质量上,它还能改变晶体的形貌。

Li等人[18]用离子液体BmimBF4作为添加剂对溶菌酶进行结晶,发现随着离子液体用量的增加,晶体的形态发生有规律的变化:

在没有离子液体条件下,溶菌酶晶体成规则的四方型;

随离子液体浓度增大,晶体逐渐拉长变成长方体形状;

之后晶体长宽比继续增大,最终晶体变成细棒状。

上述研究都表明将离子液体作为添加剂对蛋白质结晶有显著的促进作用,不仅能优化结晶条件,改善晶型,避免多晶态现象的发生,提高晶体的衍射分辨率,而且蛋白质的活性不受离子液体的影响,仍保持不变。

3.3离子液体影响蛋白质结晶机理的探讨

（1）增加蛋白质的溶解度。

Chen等人[12]通过对溶菌酶溶解度的测定发现,离子液体的加入能够增大溶菌酶的溶解度,并且溶解度随着离子液体用量的增加而增大。

由此说明,离子液体正是通过增大溶菌酶的溶解度,降低溶液的过饱和度,从而减缓晶核的形成和生长,得到数量少、尺寸大、质量高的晶体。

（2）控制蒸汽扩散的速率。

离子液体几乎没有蒸汽压,加入离子液体之后会减慢蒸汽从蛋白质溶液到池液的扩散速度,从而降低溶液的过饱和度,这样就会减慢晶体的成核和生长。

而没有添加离子液体的溶液由于溶液的过饱和度较大,蛋白质分子过快地聚集,容易导致蛋白质沉淀[19]。

（3）增加蛋白质在溶液中的稳定性。

Wang等人[20]利用差示扫描量热法研究离子液体在结晶过程中溶菌酶热力学稳定性的影响。

随着离子液体用量的增大,溶菌酶的特征峰温度和吸热焓也随着增加,这说明离子液体能够增加溶菌酶在溶液中的稳定性,从而优化溶菌酶的结晶行为。

此外,Chen等人[12]通过计算得到溶菌酶结晶过程的热力学参数,数据表明加入离子液体之后结晶过程的焓变绝对值降低,说明离子液体降低了溶菌酶晶体的表面能,从而更有利于晶体的成核和生长;

熵变也是随着离子液体浓度的增大依次减小,说明离子液体的加入使晶体朝着更有利于生长的方向发展,这与焓变过程的变化相一致。

上述机理较为合理地解释了实验中出现的一些现象,但是这些机理多是针对某些特定的离子液体和蛋白质,具有一定的局限性,至今尚无统一的定论,有待进一步深入研究。

4总结与展望

综上所述,由于独特的物理化学性质和结构特性,离子液体在蛋白质的结晶过程中发挥着越来越重要的作用。

尤其是离子液体具有很强的设计性,其极性、水溶性、溶解度、熔点、稳定性等物理化学性质不仅可以通过阴阳离子的种类和取代基进行调控,也可以通过控制阴阳离子的大小和极性进行修饰,这为蛋白质结晶条件的筛选提供了很大的选择空间。

虽然目前已有很多有关离子液体用于蛋白质结晶的报道,但所用的离子液体大多数为咪唑类,种类比较有限,远没有发挥离子液体种类繁多、可调控性强的优势,而且离子液体在蛋白质结晶中的作用、机理等问题仍都不清楚。

可喜的是,离子液体对蛋白质调控作用的研究方法和领域正逐渐拓宽,而且在蛋白质结晶领域离子液体以其独特的优势将会引起更多学者的重视。

可以预见,在未来几年离子液体作为一种新型的结晶试剂将会有更加广阔的发展前景。

参考文献

[1]SeddonKR.JChemTechnolBiot,1997,68（4）:

351～356.

[2]WilkesJS.GreenChem,2002,4

（2）:

73～80.

[3]FullerJ,CarlinRT.JChemCrystallogr,1994,24（8）:

489～493.

[4]KaarJL,JesionowskiAM,BerberichJA,etal.JAmChemSoc,2003,125（14）:

4125～4131.

[5]BakerSN,Mc