牛奶中酪蛋白含量的测定_精品文档Word格式.docx

牛奶中酪蛋白含量的测定_精品文档Word格式.docx

《牛奶中酪蛋白含量的测定_精品文档Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《牛奶中酪蛋白含量的测定_精品文档Word格式.docx（3页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零（即正负电荷相等），此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。

酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出来。

市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。

同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pI偏离了4.7，通常偏酸。

3、酪蛋白的提纯

根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。

4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm。

在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。

二、实验器材与试剂

1、器材：

恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发皿、精密pH试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管*9、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL量筒、电子分析天平

2、试剂：

鲜牛奶、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液、乙醇-乙醚混合液（95%乙醇、无水乙醚体积比1：

1）、0.9%NaCl溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考马斯亮蓝G520染液

三、实验操作记录

1、酪蛋白的制备

将20mL牛奶盛于100mL的烧杯中加热到40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲溶液20mL。

用冰醋酸调节溶液pH至4.7，此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。

将上述悬浮液冷却至室温，离心5min（4000r/min），弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。

用蒸馏水洗涤沉淀3次（每次约20mL），离心5min（3000r/min），弃去上清液。

在沉淀中加入约20mL95%乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移到布氏漏斗中抽滤，用乙醇-乙醚混合溶液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。

将沉淀摊开在培养皿中，风干，保存至下周。

2、标准曲线的制作

取7支干净干燥试管，按下表进行编号并加入试剂。

混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为横坐标得标准曲线。

表1标准曲线的制作

试剂\编号

1（空白）

2

3

4

5

6

7

标准蛋白液/mL

——

0.1

0.2

0.3

0.4

0.6

0.8

0.9%NaCl/mL

1.0

0.9

0.7

考马斯亮蓝染液/mL

4.0

蛋白质浓度/（μg/mL）

10

20

30

40

60

80

A595nm

0.000

0.151

0.260

0.326

0.440

0.535

0.636

3、样液的测定

准确称取25mg自制酪蛋白，置于50mL烧杯中，加入约20mL0.9%NaCl，再准确加入1mol/LNaOH5mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5mL，充分振摇直至酪蛋白完全溶解为止（不溶可在50℃水浴加热至溶），全部转移至50mL容量瓶中，加0.9%NaCl稀释定容至50mL，充分摇匀。

取5mL上述蛋白液，转移至另一个50mL容量瓶中，用0.9%NaCl稀释定容至50mL。

另取一支干净试管，加入样品液1.0mL及考马斯亮蓝染液4.0mL，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

四、实验结果

1、酪蛋白产量及产率计算

表2酪蛋白产量及产率计算

酪蛋白质量/g

牛奶样品质量/g

产率/g

0.78

20.03

3.89%

2、标准曲线

由散点图可以看出，后两个点与前面几个点的线性关系并不好，出现了明显的负偏差。

故在线性拟合时舍去后两个点，取前5个点进行拟合。

拟合出的直线R²

达到0.983，线性较好。

2、样品液的吸光度是0.324，对照标准曲线得酪蛋白浓度为28.40μg/mL。

称取的酪蛋白样品质量为0.0267g，稀释倍数为500倍。

ω酪蛋白=酪蛋白浓度×

1.0mL×

500样品质量×

100%=28.40×

10-6×

1×

5000.0267×

100%=53.2%

五、误差分析与讨论

1、本次制备实验中得到的蛋白质量较多，但纯度较低，分析原因如下：

1）得到的蛋白质略呈黄色，且有些发粘，说明可能脱脂不彻底，蛋白质产品中含有脂质。

2）考马斯亮蓝G520染液中有沉淀，最后影响考马斯亮蓝-蛋白质复合物溶液的吸光度。

3）配制标准溶液时操作上可能有误差，如往试管中加入溶液时挂在管壁，且最终也没有与下方溶液混合均匀，导致标准溶液的浓度可能不准，致使标准曲线不准，数据处理时也发现数据线性并不好，尤其是浓度较大时，虽然可能是超出考马斯蓝线性范围，但不能排除操作失误的可能。

2、注意事项

1）试管提前一周清洗干净并晾干，否则制作标准曲线时无法保证各管浓度。

并且不干净的试管在加溶液时容易挂管壁，不利于控制标准蛋白液浓度。

2）在配制不同浓度标准蛋白液时，各组分的体积要准确移取，特别是量较少的标准蛋白液，只要稍微洒出一点就会导致较大的相对误差

3）蛋白质粗品的洗涤一定要按照规范做，每一次离心洗涤时要将搅匀，在布氏漏斗上洗涤时要先微接抽气管，待洗出液缓慢流出后，再接紧橡皮管抽干。