目的基因的克隆转化及重组子筛选_精品文档Word下载.doc
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细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。
（3）蓝白斑筛选:
载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；
宿主细胞编码C端部分序列。
诱导物IPTG和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。
三．实验材料：
大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/LCaCl2溶液、BindingBuffer、spin-column、SPW溶液、1µ
lpMD19-TVector、5µ
lSolutionⅠ、250µ
lSolutionⅡ、350µ
lSolutionⅢ、HiBind®
MiniColumns（I）、500µ
lBufferHB、1400µ
lDNAWashBuffer等
四．实验步骤、现象、结果及分析：
Ⅰ10月24号
（1）cDNA电泳及胶回收
1.取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loadingbuffer）分别加入SYBRGold2µ
l，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。
2.把所割胶放入1.5mlEP管，称重如下表一。
表一：
cDNA琼脂糖凝胶重量
空管
2管
3管
重量（g）
0.9045
1.2280
1.2961
净重（g）
0.3235
0.3916
3.按1g/1ml的量，大致各加入400µ
lBindingBuffer，65℃水浴7min；
（每隔2－3min，摇一下）；
4.把溶液转移至spin-column，10000g离心1min，倒出套管内残液；
5.在柱子中加入300µ
lBindingbuffer，10000g离心1min，倒出套管内残液；
6.在柱子中加入700ul的SPW溶液，放置3min，10000g离心1min，去残液；
7.10000g离心1min（去乙醇）；
8.把柱子放入干净的1.5mlEP管。
加ElutionBuffer20µ
l。
室温放置1min，10000g离心1min。
9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。
选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。
表二：
cDNA吸光度测定
2组
3组
A260/A280
1.864
1.867
浓度（ng/µ
l）
146.718
128.242
（2）感受态细胞制备
1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37℃剧烈振荡培养过夜（教师准备）。
2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按1：
50取1ml菌液接种到50mlLB培养基中，37℃振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD值为0.182，1.5hr后再测其OD值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期OD600为0.2-0.4）。
3.分别取1ml菌液至1.5ml离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置10min，5000r/min，离心2min，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。
4.分别加入500µ
l预冷的0.1mol/LCaCl2，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的CaCl2中，冰上放置10分钟。
5.离心机5000r/min，离心2min，用枪头吸取弃上清，分别加入100µ
l预冷的0.1mol/LCaCl2，小心用枪头吹散，0℃保存3hr。
（3）连接和转化
组别
实验组
正对照组
负对照组
操作
连接：
从2号胶回收DNAEP管中取4µ
l，加入1µ
lpMD19-TVector、5µ
lSolutionⅠ组成10µ
l连接反应体系，在16℃下进行连接反应；
转化：
30min后加入1号100µ
l感受态细胞EP管中，以手指轻轻触碰混匀，冰中放置30min进行转化，接着42℃热激45sec，再在冰中放置1min，最后加入390µ
lLB液体培养基于37℃振荡培养50min。
取1µ
l（5ng/µ
l）质粒加入2号100µ
l感受态细胞EP管中。
无需取任何物质加入3号100µ
样品组-100µ
l：
从上述500µ
l体系中取100µ
l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。
样品组-200µ
l体系中取200µ
从上述101µ
l体系中取50µ
从上述100µ
注：
LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制：
取固体LB培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55℃左右，加入80µ
l氨苄青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：
样品组100µ
l、样品组200µ
l、正对照组、负对照组，然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布X-Gal40µ
l和IPTG10µ
Ⅱ10月25号
（1）取出过夜培养的4个平板，拍照并计数。
结果如下图所示：
图一：
l
图二：
图三：
图四：
从上述四图可以看出，图三正对照组出现大面积蓝色菌落，证明空载质粒转化成功，平板边缘菌落呈白色，是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal，导致边缘不含或少含X-Gal。
图四负对照组无菌落出现，因培养基中含氨苄青霉素，而感受态细胞无抗性，因而不能生存。
图一样品组-100µ
l出现白色和蓝色菌落，证明重组质粒转化成功，图二样品组-200µ
l也出现白色和蓝色菌落，但密度比图一高。
白色菌落密度偏高（与其他组相比）的原因：
空载质粒的摩尔数==3×
10-15mol
插入DNA片段的摩尔数==1.933×
10-12mol
空载质粒的摩尔数：
插入DNA片段的摩尔数≈1:
1000，该比值远小于1:
2到1:
10的范围，待插入DNA片段过多，当时未稀释待插入DNA，直接进行了转化实验，导致重组白色菌落密度偏大。
对图三正对照组蓝色菌落进行计数，将平板划均分为8块扇形，计数2块扇形部分内菌落数分别为850、650，平均为750，总计6000，空载质粒转化效率计算如下：
1µ
l5ng/µ
l即5ng的质粒加入2号100µ
l感受态细胞EP管中，取50µ
l加入LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/5ng=2.4×
103cfu/ng=2.4×
106cfu/µ
g质粒
（2）在超净工作台中，从样品组-100µ
l中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400µ
lLB-amp培养基中，挑选4个菌落，分别接种于1号、2号、3号、4号试管中，于37℃振荡摇菌5hr。
（3）配制10µ
l反应体系，进行PCR。
10µ
l反应体系如下：
菌液DNA2µ
引物1（10µ
M）0.4µ
引物2（10µ
2×
PCRReactionMix5µ
Taq聚合酶（2.5U/µ
l）0.2µ
超纯水2µ
由于全班共配置100个反应体系，每组50µ
l，从老师处领取后，自行分装8µ
l/管，分别标号1、2、3、4，再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养EP管并从中取出2µ
l作模板加入，后进行PCR反应。
PCR反应条件如下：
94℃变性3min；
94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；
72℃10min。
（4）电泳：
桌面薄膜依次点上marker及1、2、3、4号PCR产物各4µ
l，再分别加入1µ
lSYBRGold，充分混匀，于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。
（5）电泳完毕，取出凝胶，在紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图五所示：
Marker1234
bp
2000
1000
750
500
250
100
图五：
菌落PCR产物电泳示意图
由上图可以看出，1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右，证明转化成功。
（6）随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号，将菌液倒入1号、2号3mlLB-amp培养管中，37℃摇床过夜培养。
Ⅲ10月26号
（1）质粒提取：
1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管，分别从中取1.5ml的菌液加入1号、2号EP管，于室温下10，000xg离心1min以沉淀菌种，由于菌液超过3ml，本实验步骤重复2次。
2.倒出培养基，往沉淀中加入250µ
lSolutionⅠ/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。
3.往重悬混和液中加入250µ
lSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀7次。
避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。
4.往上述混和液中加入350µ
lSolutionIII，温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
室温下，13，
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