关于MIX.docx

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关于MIX

产品详细说明

2×MasterPCRMix

2×MasterPCRMix中含有2×TaqDNAPolymerase，2×PCRBuffer，2×dNTP及PCR反应的优化剂和稳定剂，只需加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩增。

大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，提高了效率；也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好。

且含有电泳时所必需的试剂，可直接上样电泳。

2×MasterPCRMix可以进行各种常规的PCR扩增，特别适合用于定量和半定量的PCR扩增。

二、试剂盒组份

组份

Cat：

BM321

Cat：

BM322

Cat：

BM323

2×MasterPCRMix

0.5mL

1.0mL

1.0mL×6

2×MasterPCRMix中的组份包括：

2×PCRbuffer

0.4mMdNTPs

3mMMg2＋

0.1u/μLTaqDNAPolymerase

溴酚蓝和比重增加物

三、试剂盒以外自备仪器和试剂

无菌双蒸水，模板，PCR管，可调移液器，PCR仪。

四、保存条件：

-20℃保存，一年有效。

五、注意事项：

1、 由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

2、 TaqDNApolymerase在PCR过程中每循环的出错几率约为2.2×10-5，对于大于1kb的DNA片断的克隆推荐使用出错几率更低的DNA聚合酶，例如PfuDNApolymerase。

对于普通的PCR或RT-PCR定性检测或定量检测，TaqDNApolymerase是最佳选择。

3、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 六、操作规程

1、  使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s。

2、取灭过菌的0.2mlPCR管，参考如下表格设置反转录反应（50μL反应体系）：

双蒸水

23-nμL

2×MasterPCRMix

25μL

引物I（10μM）

1μL

引物II（10μM）

1μL

模板DNA

nμL

总体积

50μL

注：

对于不同类型的模板在50µl反应体积中推荐用量如下：

哺乳动物基因组DNA：

0.1-1µg；大肠杆菌基因组DNA：

10-100ng；质粒DNA：

0.1-10ng。

过多的模板DNA容易导致非特异性的PCR产物

3、  轻轻混匀（可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀），随后2000rpm离心20s沉淀液体。

4、  如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。

如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油。

5、各设置好的PCR反应管置于PCR仪上，开始PCR反应。

a、   PCR扩增条件参考：

Step1（起始变性）：

94℃3min

Step2（变性）：

94℃30sec

Step3（退火）：

45～65℃30sec

Step4（延伸）：

72℃1min

Step5（循环）：

GoToStep2for25～35cycles

Step6（最终延伸）：

72℃10min

StepP6（临时保存）：

4℃forever

b、  PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间、循环数及镁离子的浓度等。

c、Step4（延伸）的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。

例如PCR产物的长度为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置为2分钟，以此类推。

d、对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。

对于需进行半定量或定量的PCR反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期。

6、  反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。

如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

七、常见问题分析及解决方案

常见问题

可能原因

建议解决方案

假阳性

引物设计不合适，靶序列太短或引物太短

重新设计引物

靶序列或扩增产物的交叉污染

操作时应小心轻柔，所有试剂或器材均应高压消毒，所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。

无扩增条带、

PCR产物非常少

或有非特异性条带

引物设计不佳

1、  请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。

2、  在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。

3、 引物的浓度除了测定OD值，还要做琼脂糖凝胶电泳，两个引物的条带的亮度要相当，假如相差太大，在稀释引物时要平衡其浓度。

4、  引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；

5、  在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。

待扩增片断

GC含量偏高

GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时可以使用适合扩增高GC含量DNA片断的GC-richbuffer，并相应地根据GC-richbuffer的要求或说明调整PCR反应参数的设置。

延伸时间不足。

可按照每1kb片断延伸1分钟进行设置，对于较难扩增的片断可以设置为每1kb片断延伸1.5-2分钟。

待扩增片断GC含量较高或长度较长，变性不够充分。

可以调节起始变性条件至95℃1min甚至95℃2-4min。

循环数不足

适当延长PCR的循环数。

通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。

模板含量太低

适当加大模板量，或采用巢式PCR（nestedPCR）或二次PCR。

PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件

在冰浴上设置PCR反应。

模板中含有抑制PCR反应的物质

可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。

形成引物二聚体

可以采用Touchdown等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55或50℃的方法，使退火更加充分。

镁离子浓度太高

对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。

退火温度不佳，

需要优化

如果有温度梯度PCR仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。

有弥散条带带

PCR反应中引物过多

减少引物的用量。

循环数过多

优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数。

退火温度过低

提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸。

PCRTaqMix|PCRMix

发布人：

浩然生物浏览642次【字号大中小】发布时间：

2010年10月04日打印本页

货号

产品名称

厂家

规格

单价

详细

订购

P2011

PCRMix（40次）

DongSheng

1ml

120

详细查看

订购

P2012

PCRMix（200次）

DongSheng

1ml×5

500

详细查看

订购

产品组分

P2011

2×PCRMix           1ml   1支

超纯水                  1ml   1支

P2012

2×PCR   Mix   1ml   1支×5

超纯水             1ml   1支×5

注：

本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。

体系中包含溴酚蓝的产品，PCR扩增产物可直接电泳检测。

这两类产品的扩增性能无差异。

如没特别说明提供体系中

包含溴酚蓝的包装。

保存条件

 -20℃保存2年。

 请勿保存于-70℃，防止反复冻融导致酶活降低。

产品说明

   PCRMix是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR扩增必需组分（模板与引物除外）。

使用时，仅需在扩增

体系中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染（加样次数减少）同时，由于体系内含有增强剂，能够显著增强PCR扩增的

灵敏度。

扩增产物具有3’-dA突出端。

TaqDNA聚合酶是嗜热性细菌Thermusaquaticus来源的热稳定重组型TaqDNA聚合酶，分子量为94KD。

扩增片段的长度可达5kb（简单模板）。

延伸速度为

0.9-1.2kb/min（70-75℃）。

该酶具有5’→3’聚合酶活性，无3’→5’外切酶活性。

产品特点

使用方便：

仅需加入模板和引物即可进行PCR扩增。

快速、高效：

减少加样步骤，节约时间。

可重复：

降低污染和加样错误风险

产品用途

高通量PCR检测。

高重复性PCR检测。

制备TA克隆用的PCR产物。

活性定义

   一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30min内，摄入10nmol全核苷酸所需的酶量。

质量控制

   相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因；室温放置

一周，扩增活性无明显改变。

2×PCRTaqMix的组分

 100mMKCl

 20mMTris-Cl

 3mMMgCl2

 400mMdNTP混合物

 0.1U/μlTaqDNA聚合酶

 溴酚蓝等

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产品»所有»DNA电泳»GeneRuler™DNALadders»GeneRuler™DNALadderMix,100-10,000bp

GeneRuler™DNALadders

GeneRuler™DNALadderMix,100-10,000bp

目录号#

规格、浓度

配套提供:

分析报告

MSDS

6XDNALoadingDye

SM0331

250（5x50）µg（0.5µg/µl）

2x1.00ml

SM0331

SM0332

250（25x50）µg（0.5µg/µl）

10x1.00ml

SM0332

SM0337

50µg（0.5µg/µl）

2x1.00ml

产品信息

查看大图

特点

∙适合DNA大小鉴定和粗略定量。

∙条带窄。

∙明亮参考条带（红色标记）。

∙配套提供样本DNA上样染料。

说明

GeneRuler™DNALadderMixladders推荐用于宽分子量范围双链DNA片段的大小鉴定和粗略定量（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。

这些Ladders是层析纯化的个体DNA片段的混合物。

GeneRuler™DNALadderMixladders可被T4PolynucleotideKinase（#EK0031）标记,见操作方法。

Ladders产品中配套提供6XDNALoadingDye可用于样本DNA电泳前处理。

保存缓冲液（TE缓冲液）

10 mMTris-HCl（pH 7.6）和1mMEDTA。

6XDNALoadingDye

10 mMTris-HCl（pH 7.6）,0.03%溴酚蓝,0.03%二甲苯青F