精准医疗基因检测行业分析报告Word下载.docx
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二、测序VSPCR和基因芯片，全基因组测序VS捕获测序10
三、公司能否对致病基因申请专利，垄断特定基因的检测12
四、基因测序产业链13
1、上游测序仪器公司掌握测序耗材13
2、捕获技术或是关键14
3、循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞（CTC）的良好应用前景15
4、数据的积累和分析很重要，决定竞争层次16
一、基因检测的几种技术，不仅仅是测序
基因检测是精准医疗的基础，之前市场上的报告都集中关注于基因测序，但是除了测序外，PCR（qPCR、DDPCR）、基因芯片（固相芯片、液相芯片，检测CNV、SNP）也都是临床中常用的基因检测手段。
目前高通量测序主要应用于无创产前诊断（唐氏筛查）、肿瘤基因检测、易感基因筛查；
基因芯片主要分为CNV（基因片段微缺失微重复）、SNP（单核苷酸多态性）两种，主要应用于产前诊断、药物代谢基因检测、易感基因检测；
PCR分为qPCR、DDPCR两种，主要应用于肿瘤、耳聋基因少量突变位点的检测。
1、qPCR和DDPCR
PCR在基因检测中的主要应用是多重荧光定量PCR（即qPCR），qPCR的检测方法有两种，分别是ARMS-qPCR和Tagman-qPCR，原理都是：
单核苷酸发生改变后，探针与序列的结合减弱，导致PCR反应不能正常进行，通过检测荧光产物就能知道位点是否发生了改变，并且通过荧光强度能够实现定量。
DDPCR与普通荧光定量PCR原理一样，但是它能将反应混合液分割为微小液滴，每个液滴不包含或者只包含数个反应体系，这样通过液滴数量和反应量（符合泊松分布）就能更加精确检测突变位点和突变基因含量。
这两种PCR方法的特点是：
①能够定量检测，DDPCR的精确程度很高；
②在扩增完成后就能得到结果，不需要进一步进行杂交或者测序，检测时间短。
③一般对仪器无限制，差别在于检测试剂盒。
目前主要产品有：
EGFR基因检测、KRAS基因检测、BRAF基因检测、四项耳聋基因检测等。
2、基因芯片，包含固相芯片和液相芯片
基因芯片对检测已知突变位点具有较大优势，主要分为基因片段微缺失微重复（CNV）检测、基因分型（SNP或突变）检测两种，原理是提取患者基因组DNA，然后在特定引物下扩增，纯化扩增产物与基因芯片上的探针杂交，然后在扫描仪上读取结果。
CNV主要用于产前诊断以及遗传病检测，CNV胎儿一般在妊娠期间流产，出生后的胎儿临床表现为智力低下、发育迟缓、癫痫及伴有先天性心脏病，所以医院中的心内科用得比较多。
基因分型检测可以用于大量SNP位点以及部分突变位点的检测，可以检测易感基因和基因突变位点。
国外知名的芯片公司有Illumina、Affymetrix、Agilent公司，美国基因检测公司23andMe使用的就是基因芯片检测，具体是在IlluminaHumanOmniExpress-24formatchip基础上改进而来，大约可以检测100万个SNP。
国内的博奥生物耳聋基因芯片可以检测4个基因中的9个基因突变位点、宏灏基因的高血压芯片可以对5个高血压药物相关基因位点进行检测、百傲科技有4款基因芯片产品，主要涉及药物代谢、乙醛脱氢酶、5、10亚甲基四氢叶酸还原酶检测。
值得注意的是，我们通常所说的基因芯片是固相基因芯片，也就是把核酸探针片段是结合在玻片或者塑料片上面；
而液相芯片起源于流式细胞仪，是一种以微球为基础的多指标数据采集和分析平台，微球上连接有核酸探针，并且含有荧光标记，通过杂交后的荧光反应来判断检测结果，因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，所以称为“液相生物芯片”。
液相基因芯片减少了空间限制，提供了充分的表面积，反应更为充分，所以精确度和准确度也更高。
基因芯片的特点是：
①需要先扩增，然后再杂交，少量位点检测的时间比PCR长，但是多个位点检测时比PCR方便；
②基因芯片可以实现高通量检测，特别在CNV检测方面具有优势；
③由于不同探针杂交条件的差异、空间限制等因素，高通量芯片检测时会有10%左右的假阳性\假阴性结果。
④芯片扫描仪是闭源，不同的芯片扫描仪器一般不能混用。
3、基因测序
基因测序目前也主要分为两类，分别是一代测序（Sanger测序）和二代测序（高通量测序）。
一代测序的原理是首先设计扩增区域两端的引物（探针），扩增过程中用ddNTPs终止扩增，然后电泳反应产物，检测末端荧光基团就能知道具体核苷酸序列。
一代基因测序不能高通量检测，但是它是目前所有基因检测技术中公认的“金标准”，较其他方法更加准确、可靠，是临床上最可信赖的基因诊断手段，二代测序的主要步骤是：
提纯基因组DNA、将DNA片段化、在DNA片段两端加接头（adaptor）、然后用探针去捕获目的片段、然后纯化扩增、上样测序、测序结果存储、数据分析、出具测序报告。
这其中有多种类型的公司参与，例如测序仪器公司、试剂公司、捕获探针合成公司、数据存储和分析公司、第三方测序服务公司、医院检验科等，对整个测序过程的分析很重要，这会让我们更好的理解整个测序产业链。
目前一代测序主要用于：
①单基因病多外显子的测序，或者少量基因多位点的检测；
②验证二代测序中出现的阳性结果。
二代测序主要应用于：
①无创产前筛查；
②易感基因检测；
③根据不同的Panel进行肿瘤、遗传病的检查。
一代测序的特点是：
①测序成本比较高；
②结果可靠，用于验证其他检验结果；
③读长较长，达到900bp；
④不能高通量。
二代测序的特点是：
①高通量、测序成本相对于一代测序大大下降；
②读长小，大概在200bp左右；
③单个碱基的错误率在0.1%左右，通过提升测序深度可以减少错误率；
④全基因组测序时会有随机丢失。
4、第三代测序技术
三代测序技术目前还不稳定，完全推广开来估计要10年时间。
根据已有资料显示，①三代测序实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。
②实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。
二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基，这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。
③它的精度非常高，达到99.9999%。
此外，它还有两个应用是二代测序所不具备的。
第一个是直接测RNA的序列。
既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。
RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。
第二个是直接测甲基化的DNA序列。
实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。
正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。
根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
4、测序方法的适用情况和成本比较
（1）根据对于单个样本所需测序的基因范围分三档
测序范围<
=100Kb，推荐用Sanger法测序
500Kb<
=测序范围<
100Kb，推荐用扩增子法测序
200Kb<
测序范围<
=100Mb，推荐用目标区域捕获测序
（2）根据上面的分法，成本比较
①用传统sanger法测序
每500bp测一对来回，每个测序20元（PCR+sanger测序）；
每个样本的测序成本：
100000/500*20=4000元/样本；
数据分析，500元/样本；
再加一点人工，总成本4500元/样本以内就完成了。
用高通量测序，建库2000元/样本，再加测序的上机费1000~3000元/样本，还有二代测序必须的生物信息分析费，成本上不占优势。
高通量测序在此的唯一的优势，是可以在一个试管中完成PCR，减少起始样本（DNA）用量。
②用扩增子（Amplicon）法测序
以200Kb，100样本为例；
引物及PCR，设计多重PCR引物，每个扩增子约150Bp的长度，总120000元，分摊到每样本，1200元；
PCR反应，成本20元/样本；
建库，2000元/样本；
测序：
a.Miseq平台，5G数据/run，26500元/run；
b.如果一次跑一个run，测24个样本，每个样本的测序部分的成本：
26500/24=1104元/样本；
c.如果一次跑超过24个样本，测序成本可以进一步分摊。
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数据分析，大约500元/样本；
总成本：
引物成本+扩增+建库+测序+数据分析=1200+20+2000+1104+500=4824元。
扩增子测序前一步要做多重PCR，到目前为止，多重PCR扩增效率的一致性一直是大难题。
扩增子越多，不均一性越高。
这使用大于500Kb的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。
③目标区域捕获法测序，适用范围：
100Kb<
=100Mb
采购捕获试剂盒
a.Nimblegen的SeqCapEZChoiceLibrary,96Reaction，USD30000
b.折合含25%税的每反应人民价格：
30000*6.2*1.25/96=2421元/反应
建库，捕获反应
a.建库，2000元/样本
b.捕获操作，3000元/样本
测序，Hiseq2500RapidPE150测序（临床样本追求速度，Rapid快，只用2天测序，比Hiseq2000highthroughputPE100的11天更合适）
a.每个Flowcell，75GPFdata；
b.一次每个样本测2GPFdata；
c.一个Flowcell，24个样本，因为样本之间在测序过程中的相互竞争，所以上样按每个样本3G上样，这样可以保证大部的样本可以得到2G（24*3=72G）以上的数据；
d.测序深度，假设捕获区间为7M，捕获的效率为65%（有35%为非特异的片段），2,000,000,000*0.65/7,000,000=185倍，符合绝大多数的检测需求；
e.测序成本，每个Hiseq2500rapidPE100flowcell，8万元，分摊到24个样本，80000/24=3333元/样本
数据分析，假设：
2000元/样本
总成本=捕获试剂+建库+捕获操作+测序+数据分析=2421+2000+3000+3333+2000=12754元/样本
因为片段很长，如果用扩增子测序，其测序所需的多重PCR的中的扩增子过多，所以不可行，并且Miseq或PGM的数据产量也不能很好地覆盖被测样本。
（3）所用时间比较
sanger法，如果同步进行，10Kb以内的范围，可以在1-2天内完成。
扩增子法，PCR用0.5天，建库2-3天，测序1-2天，数据分析2-3天，最快1周出结果。
捕获法，建库2-3天，捕获2-3天（杂交反应，必须慢，没法更快），测序2-3天，数据分析2-10天，最快10天出结果。
二、测序VSPCR和基因芯片，全基因组测序VS捕获测序
二代测序技术功能强大，而且随着测序成本的进一步降低，那是不是会完全取代其他基因检测手段呢？
虽然测序是主流技术，但是测序并不能取代其他检测手段
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