精准医疗基因检测行业分析报告Word下载.docx

1、二、测序 VS PCR和基因芯片，全基因组测序VS捕获测序 10三、公司能否对致病基因申请专利，垄断特定基因的检测 12四、基因测序产业链 131、上游测序仪器公司掌握测序耗材 132、捕获技术或是关键 143、循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞（CTC）的良好应用前景 154、数据的积累和分析很重要，决定竞争层次 16一、基因检测的几种技术，不仅仅是测序基因检测是精准医疗的基础，之前市场上的报告都集中关注于基因测序，但是除了测序外，PCR（qPCR、DDPCR）、基因芯片（固相芯片、液相芯片，检测CNV、SNP）也都是临床中常用的基因检测手段。目前高通量测序主要应用于无创产前诊断（唐氏筛查）、肿瘤

2、基因检测、易感基因筛查；基因芯片主要分为CNV（基因片段微缺失微重复）、SNP（单核苷酸多态性）两种，主要应用于产前诊断、药物代谢基因检测、易感基因检测；PCR 分为qPCR、DDPCR 两种，主要应用于肿瘤、耳聋基因少量突变位点的检测。1、qPCR和DDPCRPCR 在基因检测中的主要应用是多重荧光定量PCR（即qPCR），qPCR 的检测方法有两种，分别是ARMS-qPCR 和Tagman-qPCR，原理都是：单核苷酸发生改变后，探针与序列的结合减弱，导致PCR 反应不能正常进行，通过检测荧光产物就能知道位点是否发生了改变，并且通过荧光强度能够实现定量。DDPCR 与普通荧光定量PCR 原

3、理一样，但是它能将反应混合液分割为微小液滴，每个液滴不包含或者只包含数个反应体系，这样通过液滴数量和反应量（符合泊松分布）就能更加精确检测突变位点和突变基因含量。这两种PCR 方法的特点是： 能够定量检测，DDPCR 的精确程度很高； 在扩增完成后就能得到结果，不需要进一步进行杂交或者测序，检测时间短。 一般对仪器无限制，差别在于检测试剂盒。目前主要产品有：EGFR 基因检测、KRAS 基因检测、BRAF 基因检测、四项耳聋基因检测等。2、基因芯片，包含固相芯片和液相芯片基因芯片对检测已知突变位点具有较大优势，主要分为基因片段微缺失微重复（CNV）检测、基因分型（SNP 或突变）检测两种，原理

4、是提取患者基因组DNA，然后在特定引物下扩增，纯化扩增产物与基因芯片上的探针杂交，然后在扫描仪上读取结果。CNV 主要用于产前诊断以及遗传病检测，CNV 胎儿一般在妊娠期间流产，出生后的胎儿临床表现为智力低下、发育迟缓、癫痫及伴有先天性心脏病，所以医院中的心内科用得比较多。基因分型检测可以用于大量SNP 位点以及部分突变位点的检测，可以检测易感基因和基因突变位点。国外知名的芯片公司有Illumina、Affymetrix、Agilent 公司，美国基因检测公司23andMe使用的就是基因芯片检测，具体是在 Illumina HumanOmni Express-24 format chip 基础

5、上改进而来，大约可以检测100 万个SNP。国内的博奥生物耳聋基因芯片可以检测4 个基因中的9 个基因突变位点、宏灏基因的高血压芯片可以对5 个高血压药物相关基因位点进行检测、百傲科技有4 款基因芯片产品，主要涉及药物代谢、乙醛脱氢酶、5、10 亚甲基四氢叶酸还原酶检测。值得注意的是，我们通常所说的基因芯片是固相基因芯片，也就是把核酸探针片段是结合在玻片或者塑料片上面；而液相芯片起源于流式细胞仪，是一种以微球为基础的多指标数据采集和分析平台，微球上连接有核酸探针，并且含有荧光标记，通过杂交后的荧光反应来判断检测结果，因为分子杂交是在悬浮溶液中进行，所以称为“液相生物芯片 ”。液相基因芯片减少了

6、空间限制，提供了充分的表面积，反应更为充分，所以精确度和准确度也更高。基因芯片的特点是： 需要先扩增，然后再杂交，少量位点检测的时间比PCR 长，但是多个位点检测时比PCR 方便； 基因芯片可以实现高通量检测，特别在CNV 检测方面具有优势； 由于不同探针杂交条件的差异、空间限制等因素，高通量芯片检测时会有10%左右的假阳性假阴性结果。 芯片扫描仪是闭源，不同的芯片扫描仪器一般不能混用。3、基因测序基因测序目前也主要分为两类，分别是一代测序（Sanger 测序）和二代测序（高通量测序）。一代测序的原理是首先设计扩增区域两端的引物（探针），扩增过程中用ddNTPs 终止扩增，然后电泳反应产物，检

7、测末端荧光基团就能知道具体核苷酸序列。一代基因测序不能高通量检测，但是它是目前所有基因检测技术中公认的“金标准”，较其他方法更加准确、可靠，是临床上最可信赖的基因诊断手段，二代测序的主要步骤是：提纯基因组DNA、将DNA 片段化、在DNA 片段两端加接头（adaptor）、然后用探针去捕获目的片段、然后纯化扩增、上样测序、测序结果存储、数据分析、出具测序报告。这其中有多种类型的公司参与，例如测序仪器公司、试剂公司、捕获探针合成公司、数据存储和分析公司、第三方测序服务公司、医院检验科等，对整个测序过程的分析很重要，这会让我们更好的理解整个测序产业链。目前一代测序主要用于： 单基因病多外显子的测序

8、，或者少量基因多位点的检测； 验证二代测序中出现的阳性结果。二代测序主要应用于： 无创产前筛查； 易感基因检测； 根据不同的Panel 进行肿瘤、遗传病的检查。一代测序的特点是： 测序成本比较高； 结果可靠，用于验证其他检验结果； 读长较长，达到900bp； 不能高通量。二代测序的特点是： 高通量、测序成本相对于一代测序大大下降； 读长小，大概在200bp 左右； 单个碱基的错误率在0.1%左右，通过提升测序深度可以减少错误率； 全基因组测序时会有随机丢失。4、第三代测序技术三代测序技术目前还不稳定，完全推广开来估计要10 年时间。根据已有资料显示，三代测序实现了DNA 聚合酶内在自身的反应速

9、度，一秒可以测10 个碱基，测序速度是化学法测序的2 万倍。 实现了DNA 聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基，这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。 它的精度非常高，达到99.9999%。此外，它还有两个应用是二代测序所不具备的。第一个是直接测RNA 的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA 为模板复制DNA 的逆转录酶也同样可以。RNA 的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA 序列

10、。实际上DNA 聚合酶复制A、T、C、G 的速度是不一样的。正常的C 或者甲基化的C 为模板，DNA 聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C 是否甲基化。4、测序方法的适用情况和成本比较（1）根据对于单个样本所需测序的基因范围分三档测序范围 = 100Kb，推荐用Sanger 法测序500Kb = 测序范围 100Kb，推荐用扩增子法测序200Kb 测序范围 = 100Mb，推荐用目标区域捕获测序（2）根据上面的分法，成本比较用传统sanger 法测序每500bp 测一对来回，每个测序20 元（PCR + sanger 测序）；每个样本的测序成本：100000/500 *

11、20 = 4000 元/样本；数据分析，500 元/样本；再加一点人工，总成本4500 元/样本以内就完成了。用高通量测序，建库2000 元/样本，再加测序的上机费10003000 元/样本，还有二代测序必须的生物信息分析费，成本上不占优势。高通量测序在此的唯一的优势，是可以在一个试管中完成PCR，减少起始样本（DNA）用量。用扩增子（Amplicon）法测序以200Kb，100 样本为例；引物及PCR，设计多重PCR 引物，每个扩增子约150Bp 的长度，总120000 元，分摊到每样本，1200 元；PCR 反应，成本 20 元/样本；建库，2000 元/样本；测序：a. Miseq 平台

12、，5G 数据/run，26500 元/run；b. 如果一次跑一个run，测24 个样本，每个样本的测序部分的成本：26500/24=1104 元/样本；c. 如果一次跑超过24 个样本，测序成本可以进一步分摊。_数据分析，大约500 元/样本；总成本：引物成本+扩增+建库+测序+数据分析=1200 + 20 + 2000 + 1104 + 500 = 4824元。扩增子测序前一步要做多重PCR，到目前为止，多重PCR 扩增效率的一致性一直是大难题。扩增子越多，不均一性越高。这使用大于500Kb 的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。目标区域捕获法测序，适用范围：100Kb = 100Mb

13、采购捕获试剂盒a. Nimblegen 的SeqCap EZ Choice Library, 96 Reaction，USD30000b. 折合含25%税的每反应人民价格：30000*6.2*1.25/96=2421 元/反应建库，捕获反应a. 建库，2000 元/样本b. 捕获操作，3000 元/样本测序，Hiseq 2500 Rapid PE150 测序（临床样本追求速度，Rapid 快，只用2 天测序，比Hiseq 2000 high throughput PE100 的11 天更合适）a. 每个Flowcell，75G PF data；b. 一次每个样本测2G PF data；c. 一

14、个Flowcell，24 个样本，因为样本之间在测序过程中的相互竞争，所以上样按每个样本3G 上样，这样可以保证大部的样本可以得到2G（24*3=72G）以上的数据；d. 测序深度，假设捕获区间为7M，捕获的效率为65%（有35%为非特异的片段），2,000,000,000 * 0.65 / 7,000,000 = 185 倍，符合绝大多数的检测需求；e. 测序成本，每个Hiseq 2500 rapid PE100 flowcell，8 万元，分摊到24 个样本， 80000/24=3333 元/样本数据分析，假设：2000 元/样本总成本=捕获试剂 + 建库 + 捕获操作 + 测序 + 数据

15、分析 = 2421 + 2000 + 3000 +3333 + 2000 = 12754 元/样本因为片段很长，如果用扩增子测序，其测序所需的多重PCR 的中的扩增子过多，所以不可行，并且Miseq 或PGM 的数据产量也不能很好地覆盖被测样本。（3）所用时间比较sanger 法，如果同步进行，10Kb 以内的范围，可以在1-2 天内完成。扩增子法，PCR 用0.5 天，建库2-3 天，测序1-2 天，数据分析2-3 天，最快1 周出结果。捕获法，建库2-3 天，捕获2-3 天（杂交反应，必须慢，没法更快），测序2-3 天，数据分析2-10 天，最快10 天出结果。二、测序 VS PCR和基因芯片，全基因组测序VS捕获测序 二代测序技术功能强大，而且随着测序成本的进一步降低，那是不是会完全取代其他基因检测手段呢？虽然测序是主流技术，但是测序并不能取代其他检测手段