基因工程总复习资料.docx

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基因工程总复习资料

第一章

1.基因工程：

利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术

2基因克隆：

在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，转入宿主细胞使这得以永久保存和复制的过程称为基因克隆。

（基因工程或重组DNA技术则侧重于验证上述过程所获得遗传物质新组合在宿主细胞内的表达与功能鉴定）

3.重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。

4.基因操作：

对生物体的遗传物质进行人为的操作，使之发生修饰和改变的过程。

简答

说明基因工程的理论基石和技术基础

理论基石（三大发现）：

DNA是遗传信息的载体；DNA的双螺旋机构模型及其半保留复制机理；中心法则和遗传密码及其通用性。

技术基础（三大发明）：

DNA的体外切割和连接；载体和宿主的发现、改造和利用；DNA测序、电泳分离和分子杂交（Southern、Northern和WestBlot）

简述基因工程研究的主要内容

1）克隆载体的研发2）受体系统的研发3）目的基因研究4）工具酶

5）新技术研究（基因枪、放射性同位素探针、PCR等）

简述基因工程的主要应用领域

1）基因工程药物（重组活性多肽或蛋白、疫苗和DNA疫苗等）

2）转基因作物（抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆及生物反应器等）

3）转基因动物（乳腺生物反应器）

4）工业（纤维素酶、酿造业菌株、抗菌素生产菌株的工程改造，等）

5）环保（生物降解塑料原料基因工程和生物防治农药污染基因工程等）

用5个词描述基因工程的过程。

（找、剪、连、转、选）

第二章天然DNA的制备

DNA变性：

是指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。

DNA复性：

变性的DNA的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称为DNA的复性。

Tm值：

将紫外吸收的增加量达最大量的一半时的温度值称为熔解温度（Tm）

简述DNA与基因工程有关的主要特性。

1）变性：

在一定的条件下，DNA双链因链间氢键破坏而解链的过程。

如温度变性，90℃足以使所有的DNA变性；其他,如pH、离子强度、脱水剂等。

2）复性：

变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链DNA的过程。

若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。

以上是PCR反应的依据。

3）带电性：

一般pH下，带负电荷，可电泳分离。

4）水溶解性：

DNA属于生物大分子，且带电荷，通常分子外形成水膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀，这是DNA提取和分离的依据。

简要说明天然DNA的主要提取过程。

1）生物材料的准备

使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最高的组织。

如细菌培养至对数生长期后期；植物材料用幼嫩植株，且暗培养1~2天或黄化苗；动物以肝脏为好，须将胆囊除尽。

2）细胞的裂解

裂解不够，DNA得率低；裂解过猛，DNA断裂。

细菌可用溶菌酶、NaOH+SDS、煮沸、冰冻或超声波等方法处理。

动植物组织，先粉碎材料，再裂解细胞。

3）DNA的分离和抽提

根据待提DNA的性质，将其与其他组分分离，进一步抽提DNA。

一般先除去蛋白质，再沉淀DNA。

提取质粒DNA时，先调节裂解液的pH值到12.6，使所有DNA沉淀，再调节pH值到中性，使质粒DNA复性从沉淀中释放出来。

用RNase水解除去RNA

制备大分子DNA应注意的两个原则：

①防止和抑制内源Dnase对DNA的降解；②尽量减少溶液中DNA的机械剪切破坏。

第三章分子克隆工具酶

限制性核酸内切酶：

一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

同裂酶：

识别序列相同而来源不同的酶。

同尾酶：

来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶

限制酶的Star活性：

在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。

限制性图谱：

DNA分子上限制性核酸内切酶的识别序列分布图称限制性图谱（restrictionmap），或物理图谱

平末端；两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。

粘性末端：

两链的断裂位置交错、对称地绕着一个对称轴排列所形成的断裂。

衔接头：

一段已知序列且含有限制性核酸酶切酶识别序列和粘性末端的DNA片段

连接子：

一个较短的已知序列的且能都被限制性核酸酶切酶切割形成特定粘性末端的DNA片段，片段未被内切酶切割时是末端是平末端。

连接酶：

六大酶类之一，催化两个不同分子或同一分子的两个末端连接的酶。

基因工程中常用的酶有哪些？

各有何的用途？

限制性核酸内切酶：

识别DNA的特异性序列，并在特定位点上切割DNA,将两条链上的一个磷酸二酯键断开，在基因工程操作中，用同一内切酶切割载体和目的基因，以形成相同的末端，用于目的基因和载体连接。

DNA连接酶：

进行缺刻修复，连接两个DNA分子；一般利用DNA连接酶将载体和目的基因连接起来

DNA聚合酶：

催化DNA的合成，通常用于PCR反应，以后的大量的目的基因。

何谓定向克隆？

如何进行？

即将待克隆的核酸分子按一定的方向连接入载体的分子克隆方法

1，利用不同的限制性核算内切酶切割目的基因的两端，以形成不同的粘性末端2，在克隆载体的插入位置设置对应的两种不同的内切酶位点，经对应的内切酶切割后形成与目的基因互补的粘性末端3，DNA连接酶处理目的基因和克隆载体（克隆载体插入位置上设置两个不同的限制性内切酶位点，在外源DNA分子两端也放上相应的两个限制性酶切序列，经限制性酶消化后，所产生的DNA黏性末端分别互补结合，外源DNA就可定向插入载体。

）

说明限制性核酸内切酶产生Star活性的原因及其克服措施。

限制酶的Star活性：

在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。

Star活性因限制酶种类、DNA和反应条件的不同而不同，一般是由于一下原因：

高浓度酶、高浓度甘油、低离子强度、Mn2+取代Mg2+或高pH。

克服措施：

①减少酶的用量，以避免过分酶切

②减少甘油浓度

③保证反应体系中无有机溶剂或乙醇

④提高离子强度到100~150mmol/L

⑤降低反应PH至PH7.0

⑥保证使用Mg2+作为二价阳离子等

第4、5章分子克隆载体

1.载体：

能将所承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。

2.表达载体：

含有强启动子、外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达的载体。

3.报告载体：

一种易于用生化方法检测表达产物的基因作为报告基因，通常由p-Basic、p-Enhancer、p-Promoter、p-Control组成的载体。

4.质粒载体：

以质粒DNA分子为基础构建而成的载体，主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA基因文库。

5.质粒：

细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。

6.ccc-DNA：

超螺旋共价闭环DNA分子

7.迁移作用：

由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒转移的现象称为迁移作用。

8.接合质粒：

含tra基因的质粒，分子较大，拷贝数较少，宿主广，不安全，使用时应特别注意（tra基因，指令产生菌毛（pilus），促使宿主与受体接合，导致遗传物质转移）

9.非接合质粒：

不含tra基因的质粒，分子小，拷贝数多，不会自行接合转移，比较安全。

10.显性质粒（表达型质粒）:

除了控制与本身复制和转移相关的基因外，还携带其他基因，使宿主呈现出新性状的质粒。

11.隐蔽质粒：

宿主细胞含有，但无异样性状表露的质粒

12.Cosmid（粘粒载体）：

由质粒和含有cos位点的λDNA片段组装成一类新的克隆载体

13噬菌粒载体：

由质粒和单链噬菌体的部分序列重组而成的载体，称为噬菌粒（Phagemid或Phasmid）。

能以质粒的方式进行高拷贝复制（500），在辅助噬菌体存在下，又能以M13噬菌体方式进行复制和包装。

14定位整合克隆载体：

除了一般质粒克隆载体必须具备的元件外，还含一或两个与整合平台区域核苷酸同源的序列（长度最好在1kb以上）。

通过同源重组，把外源DNA片段定位整合到整合平台。

15.整合平台：

指受体细胞基因组上给定的一个供外源DNA定位整合区域。

可处于基因区，也可处于基因间隔区。

16.YAC（酵母人工染色体）：

是将酵母染色体DNA的端粒（TEL）、DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必要的选择标记（HISA4和TRP1）基因序列克隆到pBR322中，构建成YAC克隆载体。

此克隆载体的sup4基因上，组装了供插入外源DNA片段的克隆位点EcoRI

17.PAC（P1人工染色体）：

利用P1噬菌体基因组元件所构建的大片段DNA克隆系统。

18.BAC（细菌人工染色体）：

利用细菌的F质粒及其调控基因为基础构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段DNA（100～300kb）的细菌染色体克隆载体。

19.诱导型表达载体：

指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。

20.反义表达载体：

是利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。

21.组织特异性表达载体：

是指有一些特殊的调控序列（如启动子）可以调控基因只在一定的组织中有效的表达的载体。

22.松弛型质粒：

在细菌染色体外能大量独立复制的质粒。

每个细菌中可存在数百到数千个拷贝。

23.严谨性质粒：

复制受到严格控制，每个细胞中的数量只有1～2个，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，也不复制的质粒。

24.附加体：

一类在细菌和某些真核细胞中存在的染色体外的遗传物质，能在细胞中独立存在并进行自我复制，也能整合到染色体，随同染色体的复制而进行复制。

25.转化子：

受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，经这一过程而获得外源遗传物质的受体菌称为转化子。

26.重组子：

含有重组DNA分子的转化细胞。

27.基因打靶：

是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。

28.限制修饰系统：

是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。

29.质粒不亲和性：

不同质粒因亲缘关系密切等原因而表现出不能寓于同一细胞中的特性

30.多克隆位点：

DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。

能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

31.α－互补：

是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β－半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。

按来源可将基因克隆载体分为哪几类？

并说明各自的主要特点。

质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）柯斯质粒载体（cosmid）

人工染色体（如YAC、BAC）

按功能分类：

克隆载体、报告载体和表达载体。

作为克隆载体必须具备的主要条件是什么？

（1）必须含有允许外源DNA片断组入的合适位点。

并且这样的克隆位点应尽可能的多。

（2）克隆载体应能携带外源基因进入受体细胞，或能在受体细胞中自我复制；或能整合到受体细胞DNA中同步复制。

（3）克隆载体必须含有供选择用的标记基因。

以有利于克隆子的筛选和鉴定。

（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞