抗体制备技术的发展及其医学应用Word文档下载推荐.docx

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多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生、针对多种抗原决定簇混合抗体。

因为天然抗原是由多种抗原分子组成，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应抗体。

由于常规抗体多克隆性质，加之不同批次抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原特异性均质且能保证无限量供应抗体是免疫化学家长期梦寐以求目标。

随着杂交瘤技术诞生，这一目标得以实现。

1抗体发展

抗体研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。

1.1免疫血清学研究阶段

免疫动物产生抗体是多种抗体混合物，所以早期制备抗体是多克隆抗体.多克隆抗体是人类有目地利用抗体第1步，其在生物医学等方面应用已有上百年发展历史.但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中应用。

1.2单克隆抗体研究阶段——杂交瘤技术诞生

淋巴细胞杂交瘤技术诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展必然结果，抗体生成克隆选择学说、抗体基因研究、抗体结构与生物合成以与其多样性产生机制揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞体外培养、细胞融合与杂交细胞筛选等提供了技术贮备。

1975年8月7日，Kohler和Milstein大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞进行融合。

融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）培养基（HAT）中生长进行选择。

在融合后细胞群体里，尽管未融合正常脾细胞和相互融合脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞HGPRT和亲本骨髓瘤细胞连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。

试验结果完全像起始设计那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体克隆化杂交瘤细胞系。

用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。

生长杂交瘤小鼠血清和腹水中含有大量同质抗体，即单克隆抗体。

这一技术建立后不久，在融合剂和所用骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。

最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）融合效果更好，且避免了病毒污染问题，从而得到广泛应用。

随后建立骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链变种，所以由它们产生杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定抗原抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等不足。

再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术问世，不仅带来了免疫学领域里一次革命，而且它在生物医学科学各个领域获得极广泛应用，促进了众多学科发展。

Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

1.3基因工程抗体技术研究阶段

自从第一个单克隆抗体产生以来,单抗已广泛地应用于疾病诊治上。

然而长期以来,临床上使用单抗多为鼠源性单抗,存在着很大弊端,最突出地表现在其异源性异质性所引起人抗小鼠抗体反应或超敏反应,一方面降低了单抗效价,另一方面又会给病人带来严重后果。

因此,对鼠源性单抗进行改进以与人源性单抗研制成为单抗研究主要方向。

为了克服传统鼠源性单抗存在弊端,随着分子生物学和细胞生物学快速发展,单克隆抗体制备技术取得了比较大进展,包括对鼠源性单抗改造、人源性单抗研制与对抗体分子结构和功能改造,尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因转染色体小鼠技术为代表人源性单抗制备技术研制最为瞩目。

1）人鼠嵌合抗体和重构型抗体

指用人恒定区取代小鼠恒定区，保留鼠单抗可变区序列，形成一个人-鼠杂合抗体。

其研制程序快，可大幅度降低异源抗体免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部特异性和亲和力。

另外，它还具有人抗体效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导细胞毒作用（ADCC）等。

1984年报道研究出了人-鼠杂交瘤构建方法,并在1987年进行了第1次临床试验。

临床研究表明,嵌合抗体副反应轻，产生人抗鼠抗体（HAMAs）反应率较鼠源性单抗低，而且在体内半衰期也比相应鼠单抗长6～8倍。

现已制备出大量抗结肠癌、乳癌、B与T细胞恶性肿瘤嵌合抗体，主要是针对肿瘤相关抗原。

1997年Rituxan和Herceptin在美国相继获准用于临床肿瘤治疗，Rituxan是以B细胞CD20分子为靶点人鼠嵌合抗体，对非霍奇金B细胞淋巴瘤有疗效。

Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白单抗，临床研究表明对乳腺癌有效，与化疗药物联合则有更显著疗效。

表皮细胞生长因子受体（EGFr）在人鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高表达，因此抗EGFr人鼠嵌合抗体也进入临床研究阶段[110]。

重构型抗体进一步减少了鼠源蛋白在嵌合抗体内含量。

2）抗体分子片段（小分子抗体或抗体衍生物）

完整抗体分子很难用基因工程生产，且应用时不易进入病变组织，所以利用DNA重组技术制备抗体片段成为研究重点。

主要抗体片段包括Fab片段和Fv片段。

Fab片段保留了亲本抗体抗原结合活性，可进行基因工程生产，具有良好应用前景。

单抗Fv片段与绿脓杆菌外毒素片段（PE40）构成免疫毒素（相对分子质量67000）与用完整嵌合抗体构成免疫毒素（相对分子质量190000）比较，前者可使在裸鼠移植人体肿瘤完全消退，而后者仅使肿瘤部分缩小。

因此分子小型化无疑是抗体工程中研制高效单抗药物一条重要途径。

抗体分子VL与VH之间仅靠较弱非共价键连接，在生理温度下不够稳定。

单链抗体（singlechainvariablefragmentScFv）是将VH、VL用一段连接肽基因连接起来重组抗体片段，可提高Fv片段稳定性。

其大小为完整抗体1/6，且不易产生HAMA，体内蓄积极少，不易与非靶细胞结合，定位成像时清晰，易于基因操作和利用基因工程大量生产，其应用主要是抗病毒和抗肿瘤。

3）双功能抗体和双特异抗体

双功能抗体是将抗体或抗体片段与其它功能分子偶联后生成一类抗体杂合分子。

功能分子部分是能够起到细胞毒作用或介导其他免疫细胞发挥效应毒素、细胞因子、酶等，赋予了抗体新功能。

1989年ChaudharyVK等人将抗卵巢癌单链抗体基因ScFv与毒素基因PE40相连，在大肠杆菌（E.coli）中表达获得具有抗原结合活性和细胞毒作用重组单链免疫毒素，治疗裸鼠体内移植瘤，可使肿瘤完全消退。

将抗体与药物代谢酶相连可用于前体药物治疗（又称“自杀基因”疗法）。

这种疗法将肿瘤细胞特异调控元件或转录元件与自杀基因相结合，可使“自杀基因”特异地在肿瘤细胞表达，从而选择性地杀伤肿瘤细胞。

双特异抗体是将抗体分子改造后生成具有2种不同抗原结合特异性抗体分子，它一个臂针对靶细胞表面抗原，另一个臂则针对免疫活性细胞表面特征性分子，从而将抗体靶向性与激活免疫细胞杀伤功能结合起来，在生物医药领域有着广泛应用前景。

4）噬菌体显示技术制备人源性抗体

基于噬菌体可把抗体片段表达在外膜能力而建立一系列抗体文库，然后用目抗原来筛选文库中相应抗体片段，再经体外加工可形成有功能完全人抗体。

用此方法可制备针对简单或复杂抗原单抗，并得到中等亲和力抗体，但该方法需用高通量筛选。

噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛抗体库技术。

1985年.Smith将外源基因插入丝状噬菌体fl外壳蛋白质基因Ⅲ区。

使目基因编码多肽在噬菌体表面表达，从而建立了噬菌体表面表达技术。

现有一些已进入临床II/III期研究，如CambridgeAntibodyTechnology（CAT）D2E7和CAT-152，分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。

噬菌体展示技术简单易行,筛选容量大，可在短期内筛选出100万～1亿个克隆,可获得高亲和力人源化抗体。

它直接从未经免疫小鼠或人淋巴细胞中得到抗体基因，可以获得完全人源化抗体，克服了杂交瘤细胞不稳定性缺点。

但该技术也存在一定局限性，如库容量有限性,密码子偏爱性，氨基酸修饰受宿主限制等,而且该技术依赖于细胞内基因表达，所以一些对细胞有毒性分子很难得到有效表达。

5）人源化抗体

利用现有无数已详细分析过小鼠抗体，取其与抗原直接接触那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

成功例子：

Herceptin：

Genentech公司抗HER2/neu抗体，用于治疗乳腺癌。

Synsgis：

Medimmune公司抗F抗体，用于治疗呼吸道病毒感染。

Zenapax：

ProteinDesignLabs（PDL）/Roche抗CD25抗体，用于抗移植排斥。

h-R3：

古巴分子免疫学中心抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，用于治疗头颈癌。

6）核糖体展示技术　

最初称为多聚核糖体展示,是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化新技术。

1997年，Hanes和Plü

ckthun等在此基础上加以发展和完善，建立了核糖体展示技术。

它基本原理是通过PCR扩增目基因DNA文库，同时加入启动子、核糖体结合位点与茎环，并置于具有耦联转录/翻译无细胞翻译系统中孵育，是目基因翻译产物呈现在核糖体表面，并形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后通过常规免疫学检测方法，通过固相化靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣核糖体复合体，再利用RT-PCR扩增，经过多次循环过程,最终筛选出高亲和力目标分子。

该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术（如噬菌体展示）局限性，如：

需转化细菌或真核细胞，因效率不高而降低库容，减少抗体多样性等，并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生库容下降，同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。

由于该技术是在体外翻译，体外筛选特点，大大缩短了试验周期，省时省力，方便快速。

2单克隆抗体在医学中应用

单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大应用价值，是亲和层析中重要配体，是免疫组化中主要抗体，是免疫检验中新型试剂，是生物治疗导向武器。

作为医学检验试剂，单抗可以充分发挥其优势。

单抗特异性强，可将抗原抗体反应特异性大大提高，减少了可能交叉反应，使试验结果可信度更大。

单抗均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果