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氨基酸代谢
第十章DNA的生物合成
一、基因（gene）
1868年瑞士外科医生Miescher从脓细胞中分离到核酸，1909Johannsen首先提出用基因代表遗传物质。
而关于基因的本质直至五十年代后才得以逐渐揭示。
定义：
DNA分子上编码生物活性产物的功能片段。
这些生物活性产物包括蛋白质和RNA。
二、中心法则（thecentraldogmaofmolecularbiology）
DNA上的基因只是一种信息，这种信息只有表达出来才有意义。
在生物体内基因表达的具体方式主要是蛋白质。
1、1958年Crick基于诸多室验依据提出生物体内遗传信息表达的基本规律——中心法则：
转录翻译
复制DNARNA蛋白质
逆转录
1970年H.Temin发现了逆转录现象，使中心法则得以扩充。
2、复制（replication）：
以DNA为模板合成DNA的过程。
其本质是将遗传信息由亲代准确地传给子代的过程。
3、转录（transcription）：
以DNA如模板合成RNA的过程，即将遗信息由DNA传给RNA的过程。
4、翻译（translation）：
以RNA的模板合成蛋白质的过程，即将遗传信息由RNA传给蛋白质的过程。
5、基因表达（geneexpression）：
指遗传信息由DNA经RNA最终表达为蛋白质的过程。
包括转录、翻译两个步骤。
6、逆转录（Reversetranscription）以RNA为模板合成DNA的过程。
即将遗信息由RNA逆向传给DNA的过程。
其遗传信息传递方向与转录相反。
故名逆转录。
本篇以中心法则为主线索，着重阐述遗传信息传递的基本规律（复制、转录、翻译）。
在此基础上，介绍基因表达的调控和分子生物学的新技术。
DNA的生物合成包括复制和逆转录，复制为大多数生物所共有，而逆转录只存在于个别生物体中，故本章着重讲述与复制相关的内容。
第一节复制的方式——半保留复制
当细胞分裂时，DNA即开始复制，其主要特征为半保留复制（semi-conservativereplication）。
一、半保留复制的定义：
DNA的两条链均可作为模板，合成出子代DNA与母代完全相同，且一条链来自母链，一条链是新合成的，这种复制方式称为Semi-conservativereplication
二、半保留复制的实验依据：
1953年Watson和Cmick在提出双螺旋模型时即已推测出复制方式。
1958年M.Messelson和F.W.Stahl用实验加以证实。
实验方法见P221图11-1
三、半保留复制的意义：
由于DNA分子中两股链有碱基互补关系，一条链即可确定其互补链的碱基序列。
按半保留复制的方式，子代保留了亲代的全部遗传信息，通过基因表达，决定了子代生物的特性和类型。
故半保留复制的意义为：
保持了代与代之间DNA序列的一致性，体现了遗传过程的相对保守性。
第二节参与复制的酶
参与复制大分子物质有：
1、底物（substrate）：
dNTP（N：
A、T、C、G）
2、模板（template）：
母代DNA的两条单链。
3、引物（primer）：
为一有3’—OH的寡核苷酸。
4、酶和蛋白：
包括聚合酶、解链解旋酶、引物酶、连接酶等。
一、DNA聚合酶
全称为DNAdependentDNApolymerese（DDDP），1958年A.Kornberg在大肠杆菌中发现了polⅠ，并在试管内证明了其聚合酶活性.
（一）DDDP催化的反应
较清楚的是原核生物的DDDP。
1、5’—3’聚合活性
以母链为模板，按碱基互补规律，DDDP在引物3’—OH上逐个加上dNTP使新链延长，见P223反应式为（dNMP）n+dNTP（dNMP）n+1+PPi
DDDP的聚合方向只能是5’—3’。
2、核酸外切酶（exonucleasae）活性：
表现为3’-5’外切酶和5’-3’外切酶活性。
3’-5’外切酶在复制的校读及损伤修复中起作用，5’-3’外切酶则在引物切除及损伤修复中起作用。
（二）种类
1、原核生物的DNA聚合酶：
E.coli中有PolⅠ、PolⅡ和polⅢ，三者在细胞中的分子数之比为400：
40：
20，但活性polⅢ是PolⅠ的10倍以上，故认为polⅢ是复制中起主要作用的酶。
polⅢ的分子量约140KD，由10种亚基组成不对称的二聚体（图11-5A），有聚合酶和3’-5’外切酶活性，每分钟催化约105个核苷酸聚合。
其中α、ε、θ组成核心酶，α亚基有5’-3’聚合酶活性，ε亚基有3’-5’外切酶活性及碱基选择功能，θ亚基可能起维系二聚体的作用。
两边的β亚基起结合模板的作用。
其余的亚基统称为γ-复合物，具体功能尚在研究中。
PolⅠ的分子量约为109KD，为单一肽链，以α螺旋为主，有A-R共18个α螺旋区（图11-5B），有聚合酶、3’-5’外切酶和5’-3’外切酶活性，每秒钟催化约10个核苷酸聚合。
由于PolⅠ只能催化合成约20个核苷酸，即从模板上脱离，故主要在校读和修复中起作用。
在特异蛋白酶作用下，PolⅠ可被水解为67KD和36KD大小两个片段（图11-5B的F、G螺旋间）：
大片段又称Klenow片段，具有聚合酶和3’-5’外切酶活性，小片段具有5’-3’外切酶活性。
这两个片段均为分子生物学研究的工具酶。
PolⅡ只在无polⅢ和PolⅠ存在的情况下才起作用，其真正功能尚未明了。
2、真核生物的DNA聚合酶：
真核生物的DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε五种
polα及δ相互配合参与复制。
以往曾认为polδ催化前导链的合成，polα催化随从链的合成。
现在认为polα与引发酶共同起引发作用，由polδ催化前导链和随从链的合成。
在链的延伸中有PCNA（增殖细胞核抗原，proliferatatingcellnucleusantigen）参与。
polε与原核的polⅠ相似，起校读、修复作用。
polβ则与原核的polⅡ相似。
polγ存在于线粒体内参与线粒体DNA（mitochondiaDNA,mtDNA）的复制。
MtDNA已知有37个基因，13为编码蛋白质或酶的基因，其余只转录RNA（22条转录tRNA，2条转录rRNA）。
由于缺乏蛋白质的保护及相应的损伤修复系统，mtDNA容易发生突变，而损伤后修复较困难。
随年龄的增长，由此引发的疾病（如盲、聋、痴呆、肌无力、糖尿病等）日显突出，已引起医学界的广泛兴趣。
原核及真核生物的DNA聚合酶归纳如下表：
原核生物
种类
功能
5’-3’聚合
5’-3’外切
3’-5’外切
PolⅠ
修复及校读
+
+
+
PolⅡ
不清
+
-
+
polⅢ
复制
+
+
+
真核生物
polα
引发
+
-
polβ
修复（同PolⅡ）
+
-
polγ
线粒体DNA复制
+
+
polδ
复制
+
+
polε
修复（同PolⅠ）
+
+
（三）特点：
1、聚合方向：
DDDP只能催化5’—3’的聚合反应。
2、需引物：
DDDP不能催化游离的dNTP从头聚合，只能以寡核苷酸的3’—OH作为合成新DNA链的起点，该寡核苷酸称作引物。
3、高度保真性：
也就是对模板的高度依赖性（即与模板保持高度的一致性），体现在：
1）DDDP能严格遵循碱基互补规律，选择与母链对应的dNTP与之配时，然后催化聚合反应。
2）当复制出错时，DDDP有即时的校读功能（Proofread）
二、解旋解链酶类：
至少有三大类
（一）解链酶（helicase）：
又名rep蛋白、DnaB蛋白
1、作用：
解开DNA双链，分开两链间的碱基对。
2、特点：
每解开一对碱基耗2个ATP
3、种类：
有DnaA、DnaB（即解链酶））、DnaC。
DnaA辨认ori，DnaC辅助解链酶（DnaB）在起始点结合并结开双链。
（二）DNA拓扑异构酶（拓扑酶：
topoisomerase）:
拓扑是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。
1、种类及作用形式：
１）拓扑酶Ⅰ只切断DNA双链中的一股，使螺旋松驰不打结，然后再将切口封起。
２）拓扑酶Ⅱ（即旋转酶,gyrase）可切断超螺旋DNA的两股链，切口处的两链旋转，使超螺旋结构松驰，在ATP存在时，DNA分子由松驰——负超螺旋。
最后将断端封好。
２、作用：
理顺ＤＮＡ的结构，防止其打结、缠绕，配合复制过程。
在ＤＮＡ复制时，拓扑酶可松弛超螺旋结构，有利于复制叉的行进和ＤＮＡ的合成；复制完成后，拓扑酶又可将ＤＮＡ引入超螺旋结构，以形成染色质。
（三）单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）
１、组成：
SSB由177个氨基酸残基组成的相同四聚体，每个SSB可覆盖ＤＮＡ单链上32个核苷酸。
２、作用：
1）与单链DNA结合，防止重新形成双螺旋
2）保护单链DNA，免受Dnase作用而降解。
三、引物酶和引发体：
（一）引物酶（primase）:
为一特殊的RNApolymerase
１、作用：
在模板复制起始部位，可催化四种NTP聚合成RNA，为DDDP提供3’—OH未端。
２、特点：
只以DNA为模板，聚合方向只能为5’—3’。
（二）引发体（primosome）：
为蛋白，酶的复合体
由DnaＡ、DnaＣ、解链酶（DnaＢ）和其它复制因子+引物酶构成引发体。
其作用是解开双链，合成引物。
四、DNA连接酶（DNAligase）
（一）作用：
催化单链缺口３’－OH与５’－P形成磷酸二酯键，将DNA片段连接起来。
（二）特点：
１、消耗ATP
２、只连接双链中的单链切口。
三种酶催化形成磷酸二酯键的比较
DNApolgmerase：
在oligdn或olign引导下，催化dNTP间形成磷酸二脂键，使dNTP聚合成ＤＮＡ链。
DNA连接酶：
催化ＤＮＡ两片段间形成磷酸二脂键，修复单链缺口。
Topoisomerase：
先切断ＤＮＡ螺旋结构，再将断端连成磷酸二脂键，改变拓朴状态。
第三节复制的过程P231
一、复制的特征：
（一）复制的起始点
DNA的复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位叫复制的起始点（originofreplication，ori）。
原核生物只有一个特定的起始部位，如E.coli的oriC。
而真核生物则有多个ori，如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点。
两个ori之间的DNA片段称为复制子（replicon）。
复制开始时，复制的起始点呈现的叉形（Y形）结构称为复制叉（replicationfork）。
（二）复制的方向
复制的方向可以有三种不同的方式：
1、单向单链复制：
两个ori，如腺病毒DNA的复制。
2、双向单链复制：
一个ori，形成一个复制叉，如质粒ColEⅠ，后叙的滚环式复制亦属此类。
3、双向双链复制：
一个ori，，形成两个复制叉——双向复制（bidirectionalreplication）。
这种方式最为常见。
（三）复制的半不连续性
作为模板的DNA双链是反向平行的，而DDDP的聚合方向只能是5’—3’，故合成的子代DNA，一条链的延伸方向与复制叉的行进方向一致，可连续合成，称为前导链或领头链（leadingstrand）；而另一条链的延伸方向与复制叉的行进方向相反，只能间断合成，称为随从链（laggingstrand）。
由于领头链的合成是连续的，而随从链的合成是不连续的，故从总体上看DNA的复制是半不连续复制（semidiscontinuousreplication）。
二、复制的过程
主要介绍原核生物的复制过程。
（一
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