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1、氨基酸代谢第十章 DNA的生物合成 一、基因（gene）1868年瑞士外科医生Miescher从脓细胞中分离到核酸， 1909 Johannsen首先提出用基因代表遗传物质。而关于基因的本质直至五十年代后才得以逐渐揭示。定义：DNA分子上编码生物活性产物的功能片段。这些生物活性产物包括蛋白质和RNA。二、中心法则（the central dogma of molecular biology）DNA上的 基因只是一种信息，这种信息只有表达出来才有意义。在生物体内基因表达的具体方式主要是蛋白质。1、1958年Crick基于诸多室验依据提出生物体内遗传信息表达的基本规律中心法则： 转录 翻译复制 D

2、NA RNA 蛋白质 逆转录1970年H.Temin发现了逆转录现象，使中心法则得以扩充。2、复制（replication）：以DNA为模板合成DNA的过程。其本质是将遗传信息由亲代准确地传给子代的过程。3、转录（transcription）：以DNA 如模板合成RNA 的过程，即将遗信息由DNA传给RNA 的过程。4、翻译（translation）：以RNA的模板合成蛋白质的过程，即将遗传信息由RNA传给蛋白质的过程。5、基因表达（gene expression）：指遗传信息由DNA经RNA最终表达为蛋白质的过程。包括转录、翻译两个步骤。6、逆转录（Reverse transcription

3、）以RNA为模板合成DNA的过程。即将遗信息由RNA逆向传给DNA的过程。其遗传信息传递方向与转录相反。故名逆转录。本篇以中心法则为主线索，着重阐述遗传信息传递的基本规律（复制、转录、翻译）。在此基础上，介绍基因表达的调控和分子生物学的新技术。DNA的生物合成包括复制和逆转录，复制为大多数生物所共有，而逆转录只存在于个别生物体中，故本章着重讲述与复制相关的内容。第一节 复制的方式半保留复制 当细胞分裂时，DNA即开始复制，其主要特征为半保留复制（semi-conservative replication）。一、半保留复制的定义：DNA的两条链均可作为模板，合成出子代DNA与母代完全相同，且一条

4、链来自母链，一条链是新合成的，这种复制方式称为 Semi-conservative replication二、半保留复制的实验依据：1953年Watson和Cmick在提出双螺旋模型时即已推测出复制方式。1958年M.Messelson和F.W.Stahl用实验加以证实。实验方法见P221图11-1三、半保留复制的意义：由于DNA分子中两股链有碱基互补关系，一条链即可确定其互补链的碱基序列。按半保留复制的方式，子代保留了亲代的全部遗传信息，通过基因表达，决定了子代生物的特性和类型。故半保留复制的意义为：保持了代与代之间DNA序列的一致性，体现了遗传过程的相对保守性。第二节 参与复制的酶参与复制

5、大分子物质有：1、底物（substrate）：dNTP(N：A、T、C、G)2、模板(template)：母代DNA的两条单链。3、引物(primer)：为一有3OH的寡核苷酸。4、酶和蛋白：包括聚合酶、解链解旋酶、引物酶、连接酶等。一、DNA聚合酶全称为DNA dependent DNA polymerese（DDDP），1958年A.Kornberg在大肠杆菌中发现了pol，并在试管内证明了其聚合酶活性. (一）DDDP催化的反应较清楚的是原核生物的DDDP。1、53聚合活性以母链为模板，按碱基互补规律，DDDP 在引物3OH上逐个加上dNTP使新链延长，见P223反应式为（dNMP）n+

6、dNTP (dNMP)n+1+PPiDDDP的聚合方向只能是53。2、核酸外切酶（exonucleasae）活性：表现为3-5外切酶和5-3外切酶活性。3-5外切酶在复制的校读及损伤修复中起作用，5-3外切酶则在引物切除及损伤修复中起作用。(二）种类1、原核生物的DNA聚合酶：E.coli中有Pol、Pol和pol，三者在细胞中的分子数之比为400：40：20，但活性pol是Pol的10倍以上，故认为pol是复制中起主要作用的酶。pol的分子量约140KD，由10种亚基组成不对称的二聚体（图11-5A），有聚合酶和3-5外切酶活性，每分钟催化约105个核苷酸聚合。其中、组成核心酶，亚基有5-3

7、 聚合酶活性，亚基有3-5外切酶活性及碱基选择功能，亚基可能起维系二聚体的作用。两边的亚基起结合模板的作用。其余的亚基统称为-复合物，具体功能尚在研究中。Pol的分子量约为109KD，为单一肽链，以螺旋为主，有A-R共18个螺旋区（图11-5B），有聚合酶、3-5外切酶和5-3外切酶活性，每秒钟催化约10个核苷酸聚合。由于Pol只能催化合成约20个核苷酸，即从模板上脱离，故主要在校读和修复中起作用。在特异蛋白酶作用下，Pol可被水解为67KD和36KD大小两个片段（图11-5B的F、G螺旋间）：大片段又称Klenow片段，具有聚合酶和3-5外切酶活性，小片段具有5-3外切酶活性。这两个片段均为

8、分子生物学研究的工具酶。Pol只在无pol和Pol存在的情况下才起作用，其真正功能尚未明了。2、真核生物的DNA聚合酶：真核生物的DNA聚合酶有、及五种pol及相互配合参与复制。以往曾认为pol催化前导链的合成，pol催化随从链的合成。现在认为pol与引发酶共同起引发作用，由pol催化前导链和随从链的合成。在链的延伸中有PCNA（增殖细胞核抗原，proliferatating cell nucleus antigen）参与。pol与原核的pol相似，起校读、修复作用。pol则与原核的pol相似。pol存在于线粒体内参与线粒体DNA（mitochondia DNA,mtDNA）的复制。MtDNA

9、已知有37个基因，13为编码蛋白质或酶的基因，其余只转录RNA（22条转录tRNA，2条转录rRNA）。由于缺乏蛋白质的保护及相应的损伤修复系统，mtDNA容易发生突变，而损伤后修复较困难。随年龄的增长，由此引发的疾病（如盲、聋、痴呆、肌无力、糖尿病等）日显突出，已引起医学界的广泛兴趣。原核及真核生物的DNA聚合酶归纳如下表：原核生物种类功能5-3聚合5-3外切3-5外切Pol 修复及校读+Pol 不清+-+pol 复制+真核生物pol引发+-pol修复（同Pol ）+-pol线粒体DNA 复制+pol复制+pol修复（同Pol ）+(三）特点：1、聚合方向：DDDP只能催化53 的聚合反应。

10、2、需引物： DDDP不能催化游离的dNTP从头聚合，只能以寡核苷酸的3OH作为合成新DNA链的起点，该寡核苷酸称作引物。3、高度保真性：也就是对模板的高度依赖性（即与模板保持高度的一致性），体现在：1）DDDP能严格遵循碱基互补规律，选择与母链对应的dNTP与之配时，然后催化聚合反应。2）当复制出错时，DDDP有即时的校读功能（Proofread）二、解旋解链酶类：至少有三大类(一）解链酶（helicase）：又名rep蛋白、DnaB蛋白1、作用：解开DNA双链，分开两链间的碱基对。2、特点：每解开一对碱基耗2个ATP3、种类：有DnaA、DnaB（即解链酶）、DnaC。DnaA辨认ori，

11、DnaC辅助解链酶（DnaB）在起始点结合并结开双链。(二）DNA拓扑异构酶（拓扑酶：topoisomerase）:拓扑是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。1、种类及作用形式：）拓扑酶只切断DNA双链中的一股，使螺旋松驰不打结，然后再将切口封起。）拓扑酶（即旋转酶,gyrase）可切断超螺旋DNA的两股链，切口处的两链旋转，使超螺旋结构松驰，在ATP存在时，DNA分子由松驰负超螺旋。最后将断端封好。、作用：理顺的结构，防止其打结、缠绕，配合复制过程。在复制时，拓扑酶可松弛超螺旋结构，有利于复制叉的行进和的合成；复制完成后，拓扑酶又可将引入超螺旋结构，以形成染色质。(三）单链DNA结

12、合蛋白（single stranded DNA binding protein，SSB）、组成：SSB由177个氨基酸残基组成的相同四聚体，每个SSB可覆盖单链上32个核苷酸。、作用：1）与单链DNA结合，防止重新形成双螺旋2）保护单链DNA，免受Dnase作用而降解。三、引物酶和引发体：(一）引物酶（primase）:为一特殊的RNA polymerase、作用：在模板复制起始部位，可催化四种NTP聚合成RNA，为DDDP提供3OH未端。、特点：只以DNA为模板，聚合方向只能为53。(二）引发体（primosome）：为蛋白，酶的复合体由Dna、Dna、解链酶（Dna）和其它复制因子+引物酶

13、构成引发体。其作用是解开双链，合成引物。四、DNA连接酶（DNA ligase）(一）作用：催化单链缺口OH与 P形成磷酸二酯键，将DNA片段连接起来。(二）特点：、消耗ATP、只连接双链中的单链切口。三种酶催化形成磷酸二酯键的比较DNA polgmerase：在oligdn或olign引导下，催化dNTP间形成磷酸二脂键，使dNTP聚合成链。DNA连接酶：催化两片段间形成磷酸二脂键，修复单链缺口。Topoisomerase：先切断螺旋结构，再将断端连成磷酸二脂键，改变拓朴状态。第三节 复制的过程 P231一、复制的特征：(一）复制的起始点DNA的复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位叫复制

14、的起始点（origin of replication，ori）。原核生物只有一个特定的起始部位，如E.coli的oriC。而真核生物则有多个ori，如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点。两个ori之间的DNA片段称为复制子（replicon）。复制开始时，复制的起始点呈现的叉形（Y形）结构称为复制叉（replication fork）。(二）复制的方向复制的方向可以有三种不同的方式：1、单向单链复制：两个ori，如腺病毒DNA的复制。2、双向单链复制：一个ori，形成一个复制叉，如质粒ColE，后叙的滚环式复制亦属此类。3、双向双链复制：一个ori，形成两个复制叉双向复制(bi directional replication) 。这种方式最为常见。(三）复制的半不连续性作为模板的DNA双链是反向平行的，而DDDP的聚合方向只能是53，故合成的子代DNA，一条链的延伸方向与复制叉的行进方向一致，可连续合成，称为前导链或领头链（leading strand）；而另一条链的延伸方向与复制叉的行进方向相反，只能间断合成，称为随从链（lagging strand）。由于领头链的合成是连续的，而随从链的合成是不连续的，故从总体上看DNA的复制是半不连续复制（semidiscontinuous replication）。二、复制的过程主要介绍原核生物的复制过程。(一