RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介.ppt

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1,NovobioCustomServices,C,1,2,第一部分RNAi服务,2,RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的研究中发现的,1998年，安德鲁法厄（AndrewZ.Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果,3,RNAi干扰机理,3,长链,4,三种RNAi干扰技术手段,4,5,RNAi的应用,高通量的研究基因功能基因敲除基因治疗基因表达调控,5,6,1.1siRNA合成服务,化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。

6,7,偌百优势siRNAoligo均由HPLC纯化，100除去尚未配对的单链多种修饰选择：

末端修饰（FAM，Biotin等），碱基修饰（2-OMe）,7,化学合成优势操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。

8,服务流程,客户提供：

siRNAoligo的序列信息或相应的靶基因信息（便于设计），以及技术要求（包括OD和nmols的精确数量、纯化类型、修饰要求等）根据序列信息，进行化学合成；HPLC纯化；经过分光光度计精确定量冻干处理我们提供：

长度19-23碱基/链的siRNA，产品形式为退火的双链RNA的冻干粉，有以下选择普通siRNA化学修饰siRNA利用2-Fluoro或2OMe修饰以提高siRNA在血清和培养基中的稳定性；作用时间长于普通siRNA；荧光标记siRNAsiRNA对照，包括普通阴性对照（与目的靶细胞中所有基因无同源性的阴性对照）、荧光标记的阴性对照（方便在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件）和siRNA阳性对照（作为一个实验系统检查，确保在实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的；常用的siRNA阳性对照有LaminA/C，Beta-Actin，P53，GAPDH等）,8,9,1.2RNAi载体构建服务,使用RNAi载体的优势实现瞬时或稳定的靶标抑制在任何类型的细胞（甚至是难转染的细胞、原代细胞和非分裂细胞）中执行RNAi通过诱导型RNAi表达来调控基因抑制选择稳定表达RNAi序列的纯细胞群通过组织特异性启动子控制体内基因表达,9,10,三种载体构建方式,shRNA干扰载体构建：

miRNA（microRNA）干扰载体构建shRNAmir干扰载体构建,10,shRNAexpressionvectors,11,11,利用miRNA产生RNAi效果,12,诺百优势,质量保证：

针对一个基因的不同位置设计4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。

多种平台载体可供选择：

shRNA载体，miRNA干扰载体（第二代干扰载体），miR-shRNA载体（第三代干扰载体）利用绿色荧光蛋白（GFP）和感兴趣的RNAi序列协同表达，方便追踪可将多个RNAi序列串联到同一表达载体中并同时表达，进行多个靶基因的同时干扰,12,13,服务流程,客户提供：

基因的AccessionNumber针对特定基因，设计RNAi序列；合成该序列并退火生成双链DNA将DNA与RNAi载体相连，连接物转化大肠杆菌测定全长序列以鉴定序列的正确性；制备甘油菌提供数据分析和报告给客户我们提供：

构建好的RNAi表达载体和相应的甘油菌,13,14,1.3RNAi干扰服务,在RNAi研究中，测定敲除效率时，通过转染控制的最适化，可以获得高敲除效果。

因此，为了将RNAi研究成功导入，需要对客户希望的细胞进行转染效率的最适化工作。

我们采用实时荧光定量PCR或免疫蛋白印迹法分析这些RNA干扰序列对靶基因蛋白表达水平的抑制的有效性,14,15,诺百优势质量保证：

针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到70%（在转染效率大于80%的情况下）；针对某靶基因的4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。

可针对客户选择的靶细胞系，进行转染条件的优化服务，以确定所选择的细胞系的有效转染条件。

15,16,服务流程,客户提供选择的细胞系和详细的细胞培养的操作步骤；选择的靶基因cDNA的序列号；抗体（如果需要Westernblot检测）对需要用于转染的细胞进行细胞培养对需要用于转染的细胞进行细胞培养；优化转染条件：

在荧光显微镜下检测FluorescentOligo或可表达GFP的干扰载体的荧光强度，评估转染效率为靶基因设计一组siRNA双链或干扰载体采用荧光定量RT-PCR或免疫蛋白印迹评估转染后某一时间点靶基因RNA水平或蛋白水平的变化可利用抗生素来筛选稳定表达shRNA或miRNA的细胞株我们提供：

转染效率分析；Knockdown分析，包括实时荧光定量PCR检测、WesternBlot图片等,16,17,第二部分慢病毒的制备和慢病毒RNAi干扰服务,17,18,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|4/19/2011,Whyneedviralvectors?

难转染细胞动物实验,19,InvitrogenProprietary&Confidential,Invitrogen病毒表达系统,瞬时表达腺病毒稳定表达慢病毒,20,慢病毒表达系统源于HIV,1983年法国科学家发现HIV；2008年获诺贝尔生理医学奖,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,弗朗索瓦丝巴尔西诺西,吕克蒙塔尼,21,LifeCycleofHIV/lentivirus,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,Plutaetal，2009,22,ApplicationsofLentiviralVectors,GenedeliveryintocellsAnimaltransgenesisClinicalgenetherapyGenome-widefunctionalstudiesofgeneexpression/knockdown,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,23,ApplicationIGenedeliveryintocells,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,24,ApplicationIIAnimalTransgenesis,Implementedsuccessfullyinmice，rats,pigs,chickens,cows,domesticcats,prairievoles,primates,etc.HighertransgeneexpressionlevelBettersurvivalrateCanbetissue-specificand/orconditionalexpression,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,25,Anti-HIVtherapy（2001.HumGeneTher.12:

2028-2029.）CNS:

neurons,astrocytes,adultneuronalstemcells,oligodendrocytes,andglialcells（2008.CurrGeneTher8:

461473;2006MolTher13:

484493;2006.HumGeneTher17:

19.）Liver,Heart,Pancreas（2006.ClinSci.110:

37-46）Kidney,muscle（2004.MolTher10:

768-779）Vaccine（2009.Vaccine27:

3443-3449;2008.PLoSOne3:

e3973）,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,ApplicationIIIClinicalGeneTherapy,26,ApplicationIV-Genome-wideFunctionalScreening,|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|10/22/2022,Alietc.2009.Blood.LentiviralRNAilibrarytoscreengenetargetscapableofalteringcelldifferentiationandproliferation,27,InvitrogenProprietary&Confidential,InvitrogenViraPowerTMHiPerformTMvectors,cPPT（fromtheHIV-1integrasegene）increasesthecopynumberoflentivirusintegratingintothehostgenomeWPREenhancesproteinexpression,DESTvectorEmGFPforexpressiontrackingandcellsorting,DESTvectorBlasticidinforstableselection,28,InvitrogenProprietary&Confidential,HowtheViraPowerLentiviralExpressionSystemworks,Gag/polRequiredforpackaging,RevAddedsafetyfeature,VSV-GenvelopeBroadTropism,OptimizedViraPowerPackagingMix,TheRevproteinrecognizestheRREelementintheviralRNA;thus,RevmakessurethattheviralRNA（unsplicedviralmRNA）isexportedintothenucleus.TheGagproteinrecognizesthePsielementintheviralRNA;thus,onlyviralRNAispackagedandnoothermammalianRNA.Theexpressionofthegag-polsequenceisrevdependent,thuspreventingtheexpressionofgag-polintheabsenceofrev.,29,InvitrogenProprietary&Confidential,LentivirusPackaging,Step1:

Co-transfectretroviralpackagingvectorsandpLENTI6.3/V5vectorwithgeneofinterestinto293FTcells.,pLP1,pLenti6.3-GOI,pLP