高中生物 第4章 现代生物技术 第15课时 聚合酶链式反应技术同步备课教学案 北师大版选修1Word文档下载推荐.docx

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答案　左链上5′端，下3′端；

右链上3′端，下5′端。

2.细胞内DNA复制条件分析

条件

组分

作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核糖核苷酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

打开DNA双螺旋

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

能量

ATP

为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3′端起点

3.PCR原理与反应过程

（1）PCR概念：

是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。

（2）条件及作用

待扩增的目的DNA片段

作为复制的模板

两种人工合成的单链DNA片段

合成DNA时所需要的特异引物

四种三磷酸脱氧核苷酸

耐热TaqDNA聚合酶

酶促作用

缓冲溶液

反应介质

（3）反应过程

①变性

温度上升到94～98℃时，目的DNA双链变性解旋为单链模板。

②复性

温度下降到40～60℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

③延伸

温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的TaqDNA聚合酶的作用下。

根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

④循环：

继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。

若开始加入了N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得N·

2n个DNA片段。

1.PCR原理

PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？

请分析原因。

答案　不相同。

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。

2.PCR反应过程

（1）PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？

若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？

答案　PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。

由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。

（2）PCR的每次循环中应如何控制温度？

答案　每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。

（3）结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？

答案　DNA的羟基（—OH）末端为3′端，磷酸基团的末端为5′端。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

归纳总结　PCR扩增与DNA复制的异同

项目

DNA复制

PCR扩增

不同点

时期

有丝分裂间期或减数分裂Ⅰ前的间期

任何时期

场所

活细胞内

细胞外

解旋酶、DNA聚合酶

耐高温的TaqDNA聚合酶

有转录，产生RNA作引物，无需人工加入

无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物

特点

边解旋边复制

先全部解旋后开始复制

缓冲液

不需缓冲液

配制缓冲液代替细胞核液

设备

无

控制温度变化的温控设备

相同点

原理

严格遵循碱基互补配对原则

都需要分别与两条模板链相结合的两种引物

DNA的两条链为模板

半保留复制

游离的四种脱氧核苷酸

1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是（　　）

A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链

B.DNA复制不需要引物

C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D.PCR扩增的对象是氨基酸序列

答案　C

解析　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；

DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链；

引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；

PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。

2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：

（1）体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是_________。

（2）此过程需要一种TaqDNA聚合酶，该酶是从____________________中分离的。

（3）与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶具有的特性是______________。

（4）与体内DNA复制相比较，PCR反应要在______________中才能进行，并且要严格控制________条件。

（5）PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是____________________________。

答案　

（1）DNA的热变性原理　

（2）水生耐热细菌Taq　（3）耐高温　（4）一定的缓冲溶液　温度　（5）2　作为DNA复制的起点

解析　

（1）PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。

（2）TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。

（3）与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶在90℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。

（4）PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。

（5）PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。

PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

一题多变

细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？

若需要，是如何实现的？

答案　需要。

细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。

易错提醒　与PCR原理有关的三个易错点

（1）酶的作用位点：

解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；

DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。

不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶和DNA连接酶：

DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；

而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

（3）PCR中的解旋过程：

PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。

二、DNA片段的PCR扩增和产物检测

DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。

阅读教材，完善下列内容：

1.DNA片段的PCR扩增

准备：

按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

↓

移液：

用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分

混合：

盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

离心：

将微量离心管放在离心机上，离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部

反应：

将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应

（1）加入离心管中的物质应包括：

模板DNA、TaqDNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸、2种引物、缓冲液。

（2）离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。

（3）热循环仪的反应程序应设定为：

（4）影响因素：

在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间越长；

引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G、C含量越多，复性温度就越高，这是因为G、C之间是由3个氢键连接，A、T之间是由2个氢键连接。

（5）PCR过程中，循环次数是不是越多越好？

答案　不是。

TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×

10－5的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。

因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在25～35个循环。

2.扩增产物的检测

（1）原理：

琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。

DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。

（2）过程

配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板

　　　　　↓

在DNA样品中加入0.2倍体积的载样缓冲液混匀

取20μL加入样品孔内

80V稳压电泳20～40min

当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源

将胶板浸入溴化乙锭溶液染色5～10min

在紫外透射仪上观察电泳条带

1.实验过程分析

（1）离心的目的是什么？

在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？

答案　离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。

微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

（2）在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？

答案　离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。

（3）PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？

还有哪些操作与此目的相同？

答案　为避免外源DNA等的污染。

在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

2.结果检测

（1）实验中为什么要测定DNA的含量？

答案　实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

（2）如何判断DNA扩增成功？

答案　①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

（3）PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？

答案　样品产物少，或产生新的DNA。

归纳总结　PCR扩增DNA片段的操作要点

（1）避免外源DNA的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。

（2）缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存，需要在－20℃冰箱内保存。

其中，DNA引物和DNA模板要避免反复冻融，否则容易造成DNA的降解。

（3）在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。

（4）为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应，需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。

（5）为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化，须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。