聚合酶链式反应.docx

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聚合酶链式反应

聚合酶链式反应

定义1：

用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。

应用学科：

生态学（一级学科）；分子生态学（二级学科）

定义2：

体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。

应用学科：

水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）

定义3：

通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。

应用学科：

细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）

定义4：

由穆利斯（K.B.Mullis）于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。

应用学科：

遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）

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概述

　　DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow

　　fragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。

现今所使用的酶（简称Taqpolymerase）,则是于1976年从温泉中的细菌（嗜热菌）（Thermusaquaticus）分离出来的。

它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。

PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。

他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。

而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。

Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。

此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。

随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。

Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下和接近沸点的温度下加热可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，因为DNA聚合酶需要一小段双链DNA来来引导双链的合成。

事实上，新合成的ＤＮＡ链的起点是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸也就是引物在模板ＤＮＡ链两端的退火位点决定

再加上DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约技了PCR术的应用和发展。

　　发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大

量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间（一般为20~30秒）后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系与反应条件

1.标准的PCR反应体系

　　PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即：

　　引物（PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

引物的多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。

但基本原则相同

长产物片段与短产物片段

引物延伸所获得的新片段最初长短是不整齐的，分为长和短二种。

短的是严格的限定在二个引物5端之间的，这正是需要扩增的片段，而长的带有不需要的尾巴。

长和短产生原因是引物所结合的模板不同而造成的。

以一个拷贝的原始模板为例，也就是只有一条待扩增的双链DNA链。

长产物片段：

在第一个反应周期中，以二条互补的DNA链为模板，引物从3端延伸。

延伸片段的5端是一端人工合成的引物。

是特定的，但是3端没有特定的止点。

进入第二个周期，引物除与原始模板结合外，还要与新和成的链，也就是长产物片段，结合。

引物在与新链结合时，由于新链模板的5端是固定的，就等于这次延伸的片段3端被固定了止点。

保证了新片段是起点和终点都限定于引物结合位点以内。

成为长短一致的短片段。

为什么短产物片段按指数增加，长产物片段按算数倍数增加呢？

由于半保留复制，不断产生新的长产物片段，引物一结合，就成为短的产物片段。

所以长产物片段几乎可以忽略不计。

所以PCR反应产物不需要再纯化。

就能保证足够纯的所需扩增的DNA片段。

用于进一步分析和研究。

是按照与扩增区段两端序列彼此互补原则设计的。

所以每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，按５到３方向延伸。

每一条新合成的链都具有新的引物结合位点。

然后再加热，进入下一轮。

随着循环次数递增新和成的引物延伸链急剧增多而成为主要的模板。

所以ＰＣＲ将受到所加的引物５末端的限定。

其终产物序列是介于二种引物５末端之间的区域。

ＰＣＲ最后结果：

PCR所用的酶主要有两种来源：

Taq和Pfu。

分别来自两种不同的嗜热菌。

其中Taq扩增效率高但易发生错配。

Pfu扩增效率弱但有纠错功能。

所以实际使用时根据需要必须做不同的选择

　　模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免非特异性增加，也就是合成不需要的DNA

缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：

缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；

一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；

二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；

辅助成分，常见的有DMSO（对DNA聚合酶1Klenow片段是有益的，但对于Taq聚合酶有抑制作用，所以一般反应中不用，但是在复合PCR中使用）、

甘油（加入5%~15%，有助于复性，尤其对G+C含量高和二级结构多的靶序列，以及扩增长片段，也就是大于1500碱基对更实用。

但是并不对所有的PCR有益，所以要摸索），氯化甲基四铵TMAC，（在反应中加入1*10的副五次方~1*10的副四次方mol/L的TMAC可促进PCR去除非特异性扩增，而不抑制TaqDNA聚合酶）等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构

这些辅助成分也叫添加剂，它可以消除引物和模板的二级结构，降低DNA双链的解链温度，使DNA双链变性完全，可增进DNA复性时的特意配对，增加或者改变DNA聚合酶稳定性以提高PCR扩增效率。

现已发现不同温度条件下添加剂会影响Taq酶的半衰期。

反应加入小牛血清白蛋白100微克每毫升或明胶0.01%，或者Tween20,0.05~0.1%有助于酶的稳定。

加入5豪摩尔的二硫苏糖醇也有类似的作用尤其在扩增片段长时，此时延伸时间也长，可加入这些酶保护剂。

但是不能加入太多，否则会抑制PCR扩增

2、PCR引物设计

　　PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。

设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同（与3撇端互补）；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

？

　　引物设计的基本原则

　　①引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

　　②引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　③引物内部不应出现互补序列。

最低限度是不能连续四个碱基互补

　　④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。

　　⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

　　⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

引物3′端不可修饰。

应为保守序列。

⑦引物的5′端可以修饰。

如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

　　v引物设计软件

　　PrimerPremier5.0（自动搜索）*

　　vOligo6（引物评价）

　　vVectorNTISuit

　　vDNAsis

　　vOmiga

　　vDNAstar

　　vPrimer3（在线服务）

3、模板的制备

　　PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

但是RNA扩增需要先反转录成cDNA才能进行正常的PCR循环。

　　模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。

也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。

法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

　　标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

？

（可以不用纯化而直接当成模板？

）

此处需要打印：

4、PCR反应条件

标准体积：

50到100微升

1反应缓冲液：

50mmol/L氯化钾，有利于引物的退火。

如果大于该

数值，则影响抑制TaqDNA聚合酶的活性。

有些反应中以NH4替代K，其浓度为16.6mol/L

10mmol/L盐酸

100ng/mL明胶

镁离子浓度总应比dNTPs的浓度高。

是1.5mmol/L

Taq聚合酶需要镁离子。

镁离子影响引物的退火，

模板与PCR产物的温度，产物的特异性，引物二聚体的形成，主要是PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTP磷酸集团可与镁离子结合。

所以镁离子含量降低。

而Taq聚合酶需要游离的镁离子

最好对每一种引物，每一种模板都进行镁离子的浓度优化。

如果引物和模板DNA原液中含EDTA等金属螯合剂也会减低游离的镁离子浓度。

最为常用的缓冲体系：

10~50mmol/L，tris.HCl,

Tris是一种双极性离子缓冲液，改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，PH8.9，有时会增加产量。

②模板：

0.1微克，要根据具体条件加以调整。

一般需100~10的5次方拷贝的DNA

③底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L

④TaqDNA聚合酶2.5U（100ul）

⑤引物浓度一般为0.1～0.5umol/L

用0.2毫升的PCR管，反应体积最小为5微升，各反应成分按比例缩

⑥反应温度和循环次数

　　变性温度和时间95℃，30s

　　退火温度和时间低于引物Tm值5℃左右，一般在45～55℃

　　延伸温度和时间72℃，1min/kb（10kb内）

　　Tm值=4（G+C）+2（A+T）

循环次数:

一般为25～30次。

循环数决定PCR扩增的产量。

模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。

但循环数并不是可以无限增加的。

一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

、

平台效应：

当引物-模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应达到饱和，出现平台效应

此处具有酶促反应动力学

出现迟早取决于，起始模板的拷贝数，所用DNA聚合酶的性能，以及底物dNTP浓度等因素。

平台效应不可避免，但是在其出现之前就可以得到足够数量的目的基因。

出现平台期时，PCR后期循环产物对数积累趋于饱和，并伴随0.3~1皮摩尔靶序列的积累。

随着循环次数增加，一方面产物浓度太高，一致自身结合，而不与引物结合。

或者产物链纠缠在一起，导致扩增效率低。

另一方面，酶活下降，引物及dNTP浓度下降，易发生错误掺入，非特异性产物增加。

所以得到足够产物时应尽量减少循环次数。

例如当按照常规PCR程序合成人类基因时，其标准反应加入1微克人类基因组DNA，一般从1毫升血样中可以获得50微克ＤＮＡ，。

　　它应含有平均长度为１０千碱基对的各种单拷贝序列分子３×１０的五次方，相当于０.１皮克的３００个核苷酸长的靶ＤＮＡ序列。

　经过３０个循环后，便可产生１微克扩增ＤＮＡ片段。

足以满足任何一种分子生物学研究。

包括直接的ＤＮＡ序列测定的需要。

实验表明，从１００微升ＰＣＲ扩增反应混合物中取１０微升，经琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下便可观察到清晰的靶ＤＮＡ条带。

　　有人报道，即便反应混合物中只含有一个拷贝的靶ＤＮＡ分子，也能有效的扩增。

　也正因为ＰＣＲ有如此高的敏锐性，所以任何ＤＮＡ样品或者实验试剂均应仔细保存，以避免污染。

PCR的循环参数

1、预变性（Initialdenaturation）

　　模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2、循环中的变性步骤

　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间

　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火（Primerannealing）

　　退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。

然后在此次实验基础上做出预估。

　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸

　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。

但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

　　延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数

　　大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸

　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

　　（四）PCR中的污染和假阳性

　　PCR中污染主要来自

　　1．样品间交叉污染；

　　2．先前PCR产物遗留（carry-over）

　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

、PCR检测

　　PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。

荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。

电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。

但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。

近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

PCR反应特点

特异性强

　　PCR反应的特异性决定因素为：

　　①引物与模板DNA特异正确的结合；

　　②碱基配对原则；

　　③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

　　④靶基因的特异性与保守性。

　　其中引物与模板的正确结合是关键。

引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。

再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高

　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

　　PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低

　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

PCR仪器

　　pcr仪器的发展pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。

自perk

in–elmercetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。

在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

　　为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。

国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。

更接近于手工操作。

ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。

以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。

在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。

温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。

对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。

　　国内外生产的几种dna扩增仪

　　1109型

　　北京新技术所与军科院联合

　　机械臂

　　变温水浴

　　电子调温

　　40×0.5ml

　　16400元/台

　　90a/b型

　　中科院遗传所

　　机械臂

　　变温水浴

　　电热

　　14000元/台

　　ptc-51a/b型

　　军事医学科学院

　　变温气流

　　电子调兼作套式

　　30×0.5ml

　　12000元/台

　　dnathermalcycler

　　perkin–elmercetus（美）

　　变温铝块

　　压缩机致冷

　　48×0.5ml

　　us$20000.-

　　thermocycler

　　#60

　　#00

　　#180

　　b..braun

　　biotech

　　（德）

　　变温水浴98℃四档

　　电热，自来水冷却

　　60×1.5ml

　　100×1.5ml

　　180×1.5ml

　　dm30000.-

　　automatictemperaturecy-clersingleblocktwinblock

　　ericompinc.（美）

　　变温铝块25～100℃

　　电热,自来水冷却

　　29×1.5ml

　　58×1.5ml

　　us$4985.-

　　us$7980.-

　　grantautogen

　　grantinstrumantltd（美）

　　变温水浴0～99℃

　　电热，自来水冷却或加冷循环器

　　50×1.5ml

　　or

　　50×1.5ml

　　us$250.–plus

　　us$15.-for

　　rack（x2）

　　technephc-1

　　phc-2

　　techneltd.（英）

　　变温铝块0～99℃三档

　　电热500w水冷100w

　　54×0.5ml

　　54×0.5ml

　　24×1.5ml

　　￡3383.–

　　￡3997.-

　　biooven

　　biothrmcorp（美）

　　变温气流

　　-150℃

　　115v11a

　　200’sof4×96plate

　　us$2990.-

　　trio-thermo-blocktb-1

　　biomertra（德）半导体变温

　　220v

　　3×20管

　　分别控温

　　dm12900.-

　　microcyclere

　　eppendorf（美）变温铝块

　　220v/100v

　　3×29管

　　us$3500.-

PCR常见问题

　　PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

　　假阴性，不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

电泳检测　　

阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失