DNA的粗提取与鉴定-(2)ppt课件PPT课件下载推荐.ppt
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(二)DNA的鉴定,条件:
二苯胺,沸水浴条件下,DNA遇二苯胺被染成蓝色,沸水浴,现象:
6,
(一)实验材料的选取,
(二)破碎细胞,获取含DNA的滤液,(三)除去滤液中的杂质(纯化),(四)DNA的析出与鉴定,二、实验设计,7,
(一)实验材料的选取,从下列材料中选取23种,原则:
菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜;
鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞;
在液体培养基中培养的大肠杆菌,选用DNA含量相对较高的组织,8,
(二)破碎细胞,获取含DNA的滤液,1、动物细胞,2、植物细胞,容易破碎,需要溶解细胞膜,鸡血细胞溶液:
加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液,想一想:
为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分大量进入血细胞,使血细胞胀裂;
加上搅拌作用,加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂,从而释放出DNA,加入一定的洗涤剂和食盐,充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液,想一想:
洗涤剂和食盐的作用分别是什么?
洗涤剂离子去污剂,能溶解细胞膜,利于DNA释放食盐NaCl,利于DNA的溶解于研磨液中,9,经研磨可破碎细胞壁,使细胞核内的DNA释放。
若研磨不充分,会使提取的DNA量变少,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理,讨论:
滤液/研磨液中可能含有哪些成分?
答:
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,想一想:
研磨的目的是什么,如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?
10,混匀后,置于沸水浴中加热5min,向试管中加入2mol/L的NaCl溶液5mL,混匀后,置于沸水浴中加热5min,11,1.DNA的溶解性,2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,(三)除去滤液中的杂质,12,讨论:
方案二与方案三的原理有什么不同?
方案二:
利用蛋白酶分解杂质蛋白,使提取的DNA与蛋白质分开;
方案三:
利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,使蛋白质变性,与DNA分离,13,(四)DNA的析出与鉴定,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95),静置23min,溶液中会出现白色丝状物粗提取DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,14,15,2.DNA的鉴定,向两支试管中分别加入2mol/LNaCl溶液5ml其中一支试管中加入DNA丝状物各加入二苯胺试剂4ml混匀后,置于沸水浴中加热5min待冷却后,比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象:
溶解丝状物的溶液变为蓝色,16,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,提取DNA,A出现蓝色B无变化,17,观察你提取的DNA颜色,如果不是白色丝状物,说明DNA中的杂质较多;
二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功,如果不呈现蓝色,可能所提取的DNA含量低,或是实验操作中出现错误,需要重新制备,四、课题成果评价,
(一)是否提取出了DNA,18,练习,1、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。
提取DNA的第一步是材料的选取,其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料,否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难;
第二步是DNA的释放和溶解,这一步是实验成功与否的关键,要尽可能使细胞内的DNA全部溶解;
第三步是DNA的纯化,即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性,最大限度地将DNA与杂质分开;
最后一步是对DNA进行鉴定,这是对整个实验的结果的检测。
19,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取DNA一样容易吗?
提取蛋白质比提取DNA的难度大。
这是因为,与DNA相比,蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多,很容易失活;
并且蛋白质的空间结构多种多样,理化性质各不相同,使得蛋白质的提取没有一种统一的方法,只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件,设计特定的方法。
20,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2molL和0.14molL对DNA有何影响?
1.在DNA的粗提取实验过程中,两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。
A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答:
B,答:
前者是溶解DNA,后者是使DNA析出,21,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成()A.砖红色B.橘黄色C.紫色D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液中的上清液?
DNA的提取,关键是对杂质的去除,由于上清液是血液中的血浆部分,不含DNA,所以要除去上清液(含有蛋白质)。
D,22,