药物设计学读书报告文档格式.docx

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学号：

0556016

指导教师：

叶德泳老师

2009年1月2日

——DiscoveryofNovelNitrobenzothiazoleInhibitorsforM.tuberculosisATPPhosphoribosylTransferase（HisG）throughVirtualScreening读书报告

在全世界范围内每年有超过2,000,000的人因肺结核而死亡，全球有1/3的人口受到了潜在的感染；

其中结核分枝杆菌（M.tuberculosis）是引起结核病的主要病原菌。

由于目前治疗肺结核花费的时间很长，而且结核分枝杆菌抗药性菌株越来越多，所以我们还需要寻找新的更加多样性的治疗肺结核的药物。

一

这篇文章的作者主要针对HisG蛋白靶标进行了虚拟筛选，然后对筛选得到的化合物进行体外活性测定，并根据有活性的化合物的结构特点，找到了一个很有意思的结构片段--硝基苯并噻唑（nitrobenzothiazole，以下简称为NBT）；

根据化学结构相似性搜索作者又找到了一批新的化合物，并对它们也进行了虚拟筛选，最终在这些含有NBT片段结构的化合物中找到了4个有活性的化合物。

最后作者又测定了这些化合物在whole-cell实验中的杀菌活性。

下面我根据自己的理解总结一下作者每个部分的工作。

第一部分，作者主要是介绍了HisG蛋白的作用及其结构特点，以及为什么选它作为筛选的靶标蛋白。

已知HisG是ATP依赖性的磷酸核糖基转移酶（ATP-PRTase：

ATP-phosphoribosyltransferase），它是组氨酸生物合成通路的第一步反应的催化剂，并且在嘌呤的生物合成过程中也起到了重要的作用。

HisG可以催化ATP和磷酸核糖焦磷酸盐（以下简称为PRPP：

phosphoribosylpyrophosphate）的反应，产生磷酸核糖化的ATP（以下简称为PR-ATP：

phosphoribosylATP）和无机化合物焦磷酸盐。

现在包括结核分支杆菌等多个物种的HisG蛋白的晶体结构都已经被解析出来。

从结构上看，结核分支杆菌的HisG蛋白的分子结构显著不同于其它的磷酸核糖基转移酶家族成员，因此被归结为一种新的独特的IV型磷酸核糖基转移酶。

HisG蛋白有两种存在形式，一种是“短”的形式，大约由200个氨基酸组成，可以与HisZ蛋白形成异八聚体；

另一种是“长”的形式，大约由300个氨基酸组成，可以与自身形成同六聚体。

结核分支杆菌的HisG蛋白属于后者，它包含有三个结构域，两个N端催化结构域，它们形成了一个开口很大的暴露于溶剂的活性位点，还有一个C端调节结构域。

其活性位点是由第I结构域和第II结构域（两个N端催化结构域）的氨基酸残基组成，包含有ATP和PRPP假想的结合位点。

与ATP结合的保守的氨基酸主要位于第I结构域；

在第II结构域包含有一个与PRPP结合的序列，由13个氨基酸组成（149-161），位于活性位点的另一面。

结核分支杆菌的HisG蛋白C端结构域，即第III结构域，可以与组氨酸结合，结合位点大约距活性位点40A左右；

组氨酸的结合能够导致HisG蛋白结构域之间的旋转，从而导致了六聚体复合物的构象发生改变，最终下调HisG的催化活性。

虽然到目前为止，还没有任何关于HisG蛋白敲除试验的报道，但是在组氨酸生物合成通路上的其它酶的删除突变体已经被构建。

Parish等人已经证明了敲除HisDC的动物对于组氨酸是营养缺陷型的，揭示了这条通路和HisDC中间体的重要性。

并且，体外的转位子插入试验也证明了HisG蛋白对于细菌生长的重要性。

另一方面，由于HisG蛋白在代谢方面的重要作用，而且该蛋白仅存在于原核生物和低级的真核生物中，在人体中并不存在，这样就不用担心其抑制剂会对人体有副作用。

所以作者设想把它作为治疗肺结核的潜在靶标。

第二部分，虚拟筛选。

本文作者是通过一个多阶段的虚拟筛选技术来寻找HisG蛋白的抑制剂的。

我把他的工作总结为两个数据库，两种对接程序。

两个数据库是指ChemBidge数据库和NCI数据库，它们都是公开的化学数据库，这两个数据库包含有超过500,000个化合物；

两种对接程序是指GOLD和FlexX。

具体的筛选流程大概是这样的：

首先，为了保证两个对接模型的可靠性，作者把反应产物PR-ATP对接到了活性位点处。

结果表明，两种对接程序对PR-ATP的结合构象的预测是相似的，它的磷酸核糖基与PRPP结合位点发生了相互作用，这与已知的实验结果是一致的。

另外，它的三磷酸盐基团与ATP结合位点附近的氨基酸残基的侧链也发生了作用。

接下来，作者使用GOLD对接程序对这两个数据库进行了初级筛选。

对接结果是通过GOLD打分来评价的，在排名靠前的化合物中，许多化合物都能在活性口袋附近形成多于3个的氢键，并且在立体结构上与结合表面也非常地匹配。

另外，有一些化合物的打分值非常高，经检查发现这些化合物都有长的脂肪链结构，含有许多的旋转键，这个现象说明这两个数据库都没有进行预先的类药性限制。

按GOLD程序本身打分的由高到低的顺序，作者从ChemBridge数据库中选择了7000个化合物，从NCI数据库中选择了前4500个化合物，总共11,500个化合物。

然后，为了进一步保证结果的可靠性，作者又对初筛选择出来的11,500个化合物进行了第二次对接，这次使用的对接程序是FlexX。

对接结束后，作者对这些化合物又进行了一致性打分，这不仅包括FlexX打分，还包括DOCK打分，PMF打分，ChemScore打分和GOLD打分，最终按照一致性打分大于等于4的标准，从ChemBridge数据库中选择了700个化合物，从NCI数据库中选择了450个化合物。

最后，作者根据Lipinski的“5规则”对挑选出来的1150个化合物进行了进一步地筛选，规定如果一个化合物违反了超过一半的规则就会被删除掉，同时，如果化合物的可旋转键的个数超过8个也同样会被删除掉。

但是这里有一点是与Lipinski规则不一致的地方，因为该蛋白的活性位点很大，所以作者就把分子量的限制定到了550Da，而不是Lipinski规则里的500Da。

经过这个筛选以后，作者从ChemBridge数据库的700个化合物里去掉了154个，从NCI数据库的450个化合物里去掉了90个，这样就只剩下了大约900多个化合物。

接下来，作者在分子图形软件sybyl里肉眼观察挑选出来的900多个化合物，观察到了三种主要的结合模式。

一种是结合在ATP结合位点，一种是结合在PRPP结合位点，另一种是结合在产物结合位点，即PR-ATP的结合位点。

这为作者最终挑选化合物提供了一定的依据。

最终，作者根据以下三个标准：

1）与活性口袋附近的残基形成氢键的可能性；

2）占据的活性位点的位置；

3）结构的特异性。

从ChemBridge数据库选择了13个化合物，从NCI数据库里选择了37个化合物，共50个化合物来进行下一步的体外活性的实验测定。

第三部分，化合物体外抑制活性的测定：

实验是通过测定ATP和PRPP反应产物PR-ATP的量来判断抑制活性的。

经过实验，总共有7个化合物（结构见附图一）在10μM浓度下显示了明显的抑制作用。

其中有三个化合物，4、6和10号化合物显示了超过50%的抑制作用，进一步地实验证明4号和6号化合物在1μM的浓度下依然分别有40%和35%的抑制作用；

对于4号化合物，预测的IC50是4μM，6号化合物的IC50是6μM，换算成抑制常数大概是2，这比已知的抑制剂如dicoumarol（60μM）和pentachlorophenol（50μM）要好很多。

第四部分，探索硝基苯并噻唑片段的作用。

根据文献调研，作者对6号化合物的NBT取代基的作用非常有兴趣，因为它的结构比较像dinitrophenol，而该化合物已经被证实对大肠杆菌里的HisG蛋白有一定的抑制作用。

所以为了研究这个片段的作用，作者又进行了以下实验。

作者首先采用了结晶的方法来证明6号化合物的预测结合模型是有效的，同时也证实了NBT片段的重要性。

接下来，为了找到更多有抑制活性的化合物，作者又在ChemBridge数据库里找到了含有NBT结构或其类似结构的4,854个化合物，并运用Lipinski规则对它们进行筛选，然后用FlexX程序对接，并对它们进行了一致性打分。

在去掉结构冗余的化合物后，作者最终选择了19个化合物，体外实验证明了其中的4个化合物（结构见附图二）在10μM的浓度下有抑制活性。

第五部分，在M.smgmatis菌株里进行whole-cell实验，即对上述在体外测得有活性的化合物进行抑菌活性测定。

M.smgmatis菌株属于分支杆菌菌株类，在基因组水平上与结核分支杆菌有很高的相似性，因此，它常被用来作为结核分支杆菌的替代品来进行潜在抑制剂抑菌活性测定。

实验结果证明了其中的两个化合物，17号和18号具有抑制细菌生长的活性。

二

下面，结合我在课堂上学到的知识对这篇文章做进一步分析。

在这篇文章中，作者使用的主要方法之一就是虚拟筛选。

虚拟筛选，也被称为计算机筛选，即在进行生物活性筛选之前，在计算机上对化合物分子进行预筛选，以降低实际筛选化合物数目，同时提高先导化合物的发现效率。

虚拟筛选技术主要可以分为两大类：

基于靶点结构的虚拟筛选和基于配体相似性的虚拟筛选，本文主要用到的是基于靶点结构的虚拟筛选技术，同时也用了基于配体相似性的虚拟筛选技术，如根据NBT化学结构相似性搜索又找到了一批新的化合物。

我们知道，基于靶点结构的虚拟筛选技术的代表性方法是分子对接，这也正是本文作者采用的主要方法。

分子对接就是将配体分子放置到受体大分子的活性位点中，预测小分子与受体结合构象及作用能的过程。

其目的是从小分子数据库中发现合适的化合物作为受体大分子的配体，分子对接可以从整体上考虑配体与受体结合的效果，能比较有效地避免其他从头设计方法中容易出现的局部作用较好，而整体结合欠佳的情况。

分子对接中配体结合构象的优化是非常重要的环节，只有找到小分子配体合适的构象，才能得到比较准确的结果。

目前，关于构象优化的算法有很多，大体上可以分为三类：

一是系统搜索，包括片段生长法，构象搜索法和构象库方法；

二是随机搜索法，包括蒙特卡罗法，模拟退火法，遗传算法和禁忌搜索法；

三是确定性搜索，主要是分子动力学模拟。

因为每种算法都有其各自的优缺点，不能说哪一种算法更好，所以本文作者也是选择了两种不同的对接程序进行虚拟筛选，其中GOLD对接程序采用的是遗传算法（随机搜索法），而FlexX对接程序采用的是片段生长法（系统搜索）。

我认为这样做的结果的可信度比只使用其中任何一种程序的结果可信度要高。

本文作者挑选化合物的依据是根据打分的高低，这里的打分结果是由打分函数来评判的。

虚拟筛选中的打分函数包括两重含义：

先对同一个分子的不同结合构象进行打分，评价各构象的结合好坏；

再对数据库中的不同分子的最好结合构象进行打分，以得到最终的结合能力从高到低的化合物分子清单。

现在的打分函数大致可以分为以下几类：

基于力场的打分函数，半经验的自由能打分函数和基于知识的打分函数。

但是由于每一种打分函数都有其不完善的地方，近年来又出现了一种新的“一致性”打分方法，它综合了五种打分：

FlexX打分、DOCK打分、PMF打分、ChemScore打分和GOLD打分，这样一种方法在降低假阳性方面的效果十分显著。

本文的作者不仅考虑了两种对接程序的打分，而且又考虑了这些化合物的一致性打分，使得结