一代测序常见问题及解决策略文档格式.docx

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5）靶序列变异：

靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性

假阳性：

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

常见原因有：

1）引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

2）靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

必要时重新设计引物。

减低酶量或调换另一来源的酶。

降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

适当提高退火温度或采用二温度点法。

4.出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

适当降低Mg2+浓度。

增加模板量，减少循环次数。

二、一代测序结果常见问题及分析

原始数据图片为：

图1

分析后无干扰峰的常规序列图为：

图2

常见问题有：

1.钉子峰

图3

产生原因：

样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体小颗粒反射激光，所以信号很高，而且所有波长（4色）都有。

解决办法：

灌胶时不要产生气泡；

使用过的毛细管在取下一段时间后，重新安装前要清洗；

要经常擦去灰尘；

样品纯化干净。

2.PCR产物测序时出现重叠峰

1）单一位点（图4）或两个位点（图5）的碱基缺失导致测序结果移码

图4

图5

碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，如上图所示，单一位点或两个位点的缺失会导致测序结果移码，影响碱基的判读。

解决策略：

①将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

或使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。

②如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。

2）测序引物碱基缺失

图6

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'

端缺失），和模板的碱基缺失有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。

3.克隆测序时出现峰形重叠

图7

产生原因：

所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；

或是送测序的菌液污染。

解决策略：

重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

4.样品有杂合/突变位点

图8

范本中有杂合型突变，也就说范本本身在这个位点出现突变；

或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。

如果范本有杂合突变或缺失，那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个点出现重叠峰（如图中箭头所示）。

建议将DNA片段克隆到载体再测序。

5.PolyA/T结构

图9

图10

如图9、10所示，在PolyA/T结构出现后，测序酶容易在模板上滑动，导致PolyA/T结构后的峰形变得杂乱，出现移码现象。

使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。

6.G/C特殊结构区

图11

序列中存在一个GC特殊结构区，在该区域后，信号迅速减弱。

上图的下半部分是对测序反应进行优化后的测序结果，在GC特殊结构后，测序信号得到一定程度的改善，但是离一般的测序结果还是相差甚远。

针对该类型的模板，一般应从反向进行测序，然后在该特殊结构区附近将两个方向的测序结果拼接起来，得到完整的序列。

7.基因中含有重复序列

图12

样品中含有重复序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致复制框滑动，较短的重复序列会导致测序结果出现移码；

而较长的重复序列会使信号衰减。

反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。

8.背景峰杂

1）模板杂

图13

产生原因：

与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。

但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。

如上图所示，该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。

改变PCR条件，重新扩增。

或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。

2）引物不纯

图14

引物不纯造成移码现象，与模板杂在峰图上均表现为背景峰杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。

重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。

9.模板不单一

1）菌液为非单克隆

图15

上图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即测序结果在载体部分很准确，而进入插入片段后出现双峰的情况。

这是由于在接种时没有挑单菌落导致的，当两个以上的正常的克隆（插入片段方向相反），或正常克隆与空载体混在一起，而通过酶切和PCR鉴定很难看出异常，尤其在T-A克隆时经常碰到。

重新涂平板挑单菌落测序。

需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。

2）PCR产物不纯

图16

在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。

（注：

PCR产物测序都是以A高峰终止。

）

对PCR产物切胶纯化，再进行测序。

10.回文结构

图17

位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。

使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。

11.酒精峰和染料峰

图18

Bigdye测序反应试剂盒（BDT）中的bigdyemix稀释过度出现染料峰，纯化的酒精没有挥发干净则会出现酒精峰，一般情况下这样的峰形出现在前200bp的某部分，大部分情况下是不影响测序结果的。

重新安排反应。

12.测序一开始就出现双峰

图19

①样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。

当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。

②样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。

通常PCR样品含非特异性扩增，存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时容易发生这种情况。

③样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。

当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。

①划平板挑取单克隆测序；

②优化PCR体系或者克隆后测序；

③选用特异性引物。

13.PCR测序结果出现N值

图20

该结果信号很强，峰型整齐，但是在该测序结果中有多个位置有重叠峰，出现N值。

造成该情况的主要原因很可能是该PCR产物中有突变体的存在。

在每个突变位点上有一个重叠的峰，由于仪器无法正确识别该处的碱基，就只能以N值代替。

暂无较好地解决办法

14.瀑布效应

图21

15.大分子荧光物质污染

图22

16.轻微荧光污染

1）

图23

2）

图24

17.宽峰

图25

18.测序结果无信号

图26

在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下，测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果；

此时则判定结果为测序无信号。

两次测序无信号，则会取消实验。