一代测序常见问题及解决策略文档格式.docx

1、5） 靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。2. 假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有：1） 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。2） 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

2、二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。3. 出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低

3、引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法。4. 出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。二、 一代测序结果常见问题及分析原始数据图片为：图1分析后无干扰峰的常规序列图为：图2常见问题有：1. 钉子峰图3产生原因：样品或毛细管内有气泡或灰尘、结晶等固体小颗粒反射激光，所以信号很高，而且所有波长（4色）都有。解决办法：灌胶时不要产生气泡；使用过的

4、毛细管在取下一段时间后，重新安装前要清洗；要经常擦去灰尘；样品纯化干净。 2. PCR产物测序时出现重叠峰1） 单一位点（图4）或两个位点（图5）的碱基缺失导致测序结果移码 图4 图5碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，如上图所示，单一位点或两个位点的缺失会导致测序结果移码，影响碱基的判读。解决策略：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。或使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。2

5、） 测序引物碱基缺失 图6测序引物有碱基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的碱基缺失有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。3. 克隆测序时出现峰形重叠 图7 产生原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是送测序的菌液污染。 解决策略：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。4. 样品有杂合/突变位点 图8范本中有杂合型突变，也就说范本本身在这个位点出现突变；或者是从基

6、因组中扩增出来的杂合位点。如果范本有杂合突变或缺失，那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个点出现重叠峰（如图中箭头所示）。建议将DNA片段克隆到载体再测序。5. Poly A/T结构 图9 图10如图9、10所示，在Poly A/T结构出现后，测序酶容易在模板上滑动，导致Poly A/T结构后的峰形变得杂乱，出现移码现象。使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。6. G/C特殊结构区 图11序列中存在一个GC特殊结构区，在该区域后，信号迅速减弱。上图的下半部分是对测序反应进行优化后的测序结果，在GC特殊结构后，测序信号得到一定程度的改善，

7、但是离一般的测序结果还是相差甚远。针对该类型的模板，一般应从反向进行测序，然后在该特殊结构区附近将两个方向的测序结果拼接起来，得到完整的序列。7. 基因中含有重复序列 图12样品中含有重复序列导致的测序结果和Poly A/T的结果一样，会导致复制框滑动，较短的重复序列会导致测序结果出现移码；而较长的重复序列会使信号衰减。反向测序有时能够顺利的通过重复序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。8. 背景峰杂1） 模板杂 图13 产生原因：与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模

8、板本身的情况。如上图所示，该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。2） 引物不纯 图14引物不纯造成移码现象，与模板杂在峰图上均表现为背景峰杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前都有一个同一碱基的小峰。重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。9. 模板不单一1） 菌液为非单克隆 图15上图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即测序结果在载体部分很准确，而进入插入片段后出现双峰的情况。这是由于在接种时没有挑单菌落导致的，当两个以上的正常的克隆（插入片段

9、方向相反），或正常克隆与空载体混在一起，而通过酶切和PCR鉴定很难看出异常，尤其在T-A克隆时经常碰到。重新涂平板挑单菌落测序。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。2） PCR产物不纯 图16在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。（注：PCR产物测序都是以A高峰终止。）对PCR产物切胶纯化，再进行测序。10. 回文结构 图17位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。使用反向引物对模板进行测序，测

10、到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。11. 酒精峰和染料峰 图18Big dye测序反应试剂盒（BDT）中的big dye mix稀释过度出现染料峰，纯化的酒精没有挥发干净则会出现酒精峰，一般情况下这样的峰形出现在前200bp的某部分，大部分情况下是不影响测序结果的。重新安排反应。12. 测序一开始就出现双峰 图19样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。通常PCR样品含非特异性扩增，存在两条分子量很接近

11、，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时容易发生这种情况。样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。划平板挑取单克隆测序；优化PCR体系或者克隆后测序；选用特异性引物。13. PCR测序结果出现N值 图20该结果信号很强，峰型整齐，但是在该测序结果中有多个位置有重叠峰，出现N值。造成该情况的主要原因很可能是该PCR产物中有突变体的存在。在每个突变位点上有一个重叠的峰，由于仪器无法正确识别该处的碱基，就只能以N值代替。暂无较好地解决办法14. 瀑布效应 图2115. 大分子荧光物质污染 图2216. 轻微荧光污染1） 图23 2） 图2417. 宽峰 图2518. 测序结果无信号 图26在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下，测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果；此时则判定结果为测序无信号。两次测序无信号，则会取消实验。