实时荧光定量PCR具体实验步骤Word下载.docx
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样品RNA浓度（µ
g/ml）计算公式为：
A260×
稀释倍数×
40µ
g/ml。
具体计算如下：
RNA溶于40µ
lDEPC水中，取5ul，1:
100稀释至495µ
l的TE中，测得A260=0.21
RNA浓度=0.21×
100×
40µ
g/ml=840µ
g/ml或0.84µ
g/µ
l
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35µ
l，剩余RNA总量为：
35µ
l×
0.84µ
l=29.4µ
g
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2〕变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×
MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）。
10×
MOPS电泳缓冲液
浓度
成分
0.4M
MOPS，pH7.0
0.1M
乙酸钠
0.01M
EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以参加25µ
l溶液。
胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×
MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µ
gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µ
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品参加上样孔。
5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓〔其大小决定于用于抽提RNA的物种类型〕，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA〔tRNA和5S核糖体RNA〕组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
①反响体系
序号
反响物
剂量
1
逆转录buffer
2μl
2
上游引物
0.2μl
3
下游引物
4
dNTP
0.1μl
5
逆转录酶MMLV
0.5μl
6
DEPC水
5μl
7
RNA模版
8
总体积
10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在参加逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因〔β-actin〕实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反响前取3μl按10倍稀释〔加水27μl并充分混匀〕为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反响体系如下：
标准品反响体系
SYBRGreen1染料
阳性模板上游引物F
阳性模板下游引物R
Taq酶
1μl
阳性模板DNA
ddH2O
32.5μl
50μl
管家基因反响体系：
SYBRGreen1染料
内参照上游引物F
内参照下游引物R
待测样品cDNA
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反响条件为：
93℃ 2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进展PCR反响。
反响体系：
PCR缓冲液
2.5ul
MgCl2溶液
1.5ul
上游引物F
0.5ul
下游引物R
dNTP混合液
3ul
Taq聚合酶
1ul
cDNA
加水至总体积为
25ul
35个PCR循环〔94℃1分钟；
55℃1分钟；
72℃1分钟〕；
72º
C延伸5分钟。
②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进展10倍梯度稀释:
将PCR产物进展10倍梯度稀释:
设定PCR产物浓度为1×
1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反响体系。
体系配置如下：
SYBRGreen1染料
10ul
1ul
dNTP
2ul
5ul
ddH2O
30ul
50ul
②将配制好的PCR反响溶液置于RealtimePCR仪上进展PCR扩增反响。
反响条件为：
93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：
PrimerPremier5.0，并遵循以下原那么：
引物与模板的序列严密互补；
引物与引物之间防止形成稳定的二聚体或发夹构造；
引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反响（即错配）。
8电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进展RealtimePCR反响。
PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反响
反转录反响参照TaKaRaRT-PCR说明书。
反转录反响条件如下。
37°
C15min〔反转录反响〕
85°
C5sec〔反转录酶的失活反响〕
RealTimePCR反响
选用脑源神经营养因子〔BDNF〕为目标基因，核糖体18SrRNA（18SrRNA）做为内参。
基因
引物序列
扩增片段长度
NR2B
NR2B（+）
CCGCAGCACTATTGAGAACA
213bp
NR2B（–）
ATCCATGTGTAGCCGTAGCC
18srRNA
18srRNA（+）
tttgttggttttcggaactga
198bp
18srRNA（–）
cgtttatggtcggaactacga
1〕按以下组份配制PCR反响液〔反响液配制请在冰上进展〕。
试剂
使用量
终浓度
SYBR®
PremixExTaqTM〔2×
〕
12.5μl
1×
PCRForwardPrimer〔10μM〕
1μl
0.4μM
PCRReversePrimer〔10μM〕
模板〔cDNA溶液〕
0.5μl
dH2O
10μl
Total
25μl
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18SrRNA。
4管BDNF或者18SrRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5μl。
2〕三步法PCR
首先95°
C作用3min。
PCR进展35个循环。
步骤
温度
时间
变性
95°
C
30秒
退火
58°
延伸
72°
融解曲线
变温速度
0秒
20°
C/秒
55°
15秒
0.1°
PCR疑难解答
当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：
1将PCR反响的试管与反响板紧贴。
2当酶反响混合物以70℃“热启动〞开场循环时，切记在参加酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。
4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
5对于有问题的PCR反响，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进展预变性，后加模板进展正常PCR扩增。
没有扩增产物：
1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；
无MgCl2的缓冲液以0.5mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。
2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，那么按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反响中可能缺少游离的Mg2+。
3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
4检查模板和引物的用量。
5增加循环次数和/或模板DNA的用量。
泳道中出现模糊条带：
1减少循环次数或模板
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