实时荧光定量PCR具体实验步骤Word下载.docx

1、样品RNA浓度（g/ml）计算公式为：A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为：35 l 0.84 l = 29.4 g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37%

2、 甲醛溶液（12.3 M）。10MOPS电泳缓冲液浓度成分 0.4MMOPS，pH 7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以参加25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品参加上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓其大小决定于用于抽提RNA的物种类型，上面一

3、条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNAtRNA和5S核糖体RNA组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反响体系序号反响物剂量1逆转录buffer2l2上游引物0.2l3下游引物4dNTP0.1l5逆转录酶MMLV0.5l6DEPC水5l7RNA模版8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000

4、rpm短暂离心。混合液在参加逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因-actin实时定量PCR -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反响前取3l按10倍稀释加水27l并充分混匀为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反响体系如下：标准品反响体系 SYBR Green 1 染料阳性模板上游引物F阳性模板下游引物RTaq酶1l阳性模板DNAddH

5、2O32.5l50l管家基因反响体系：SYBR Green 1 染料内参照上游引物F内参照下游引物R待测样品cDNA制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反响条件为：932分钟，然后93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进展PCR反响。反响体系： PCR缓冲液2.5 ulMgCl2 溶液1.5 ul上游引物F0.5 ul下游引物RdNTP混合液3 ulTaq聚合酶1 ulcDNA加水至总体积为25ul35个PCR循环941分钟；551分钟；721分钟； 72C延伸5分钟。PCR产物与 DN

6、A Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进展10倍梯度稀释: 将PCR产物进展10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反响体系。体系配置如下：SYBR Green 1 染料 10 ul1uldNTP 2ul5ulddH2O 30ul50 ul将配制好的PCR反响溶液置于Realtime PCR仪上进展PCR扩增反响。反响条件为：932分钟预变性，然后按93 1分钟，551分钟，

7、721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原那么：引物与模板的序列严密互补；引物与引物之间防止形成稳定的二聚体或发夹构造；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反响（即错配）。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进展Realtime PCR反响。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适

8、中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反响 反转录反响参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反响条件如下。37C 15 min反转录反响 85C 5 sec反转录酶的失活反响 Real Time PCR反响 选用脑源神经营养因子BDNF为目标基因，核糖体18S rRNA（18S rRNA）做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B（+）CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B（）ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s rRNA（+）tttgttggttttcggaactg

9、a198 bp18s rRNA（）cgtttatggtcggaactacga1 按以下组份配制PCR反响液反响液配制请在冰上进展。试剂 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex TaqTM2 12.5 l1PCR Forward Primer10 M 1 l0.4 MPCR Reverse Primer10 M 模板cDNA溶液 0.5 ldH2O 10 lTotal 25 l 全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.

10、5 l。2三步法PCR 首先95C 作用3 min。 PCR进展35个循环。步骤温度时间变性95C30 秒退火58延伸72融解曲线变温速度0秒20C/秒5515秒0.1PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1将PCR反响的试管与反响板紧贴。2当酶反响混合物以70“热启动开场循环时，切记在参加酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。5对于有问题的PCR反响，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进展预变性，后加模板进展正常PCR扩增。没有扩增产物：1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，那么按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反响中可能缺少游离的Mg2+。3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4检查模板和引物的用量。5增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1减少循环次数或模板